热休克蛋白27参与兔肺缺血预处理保护

　　作者：涂军伟，徐正 王万铁，吴成云，方舟溪 作者单位：1.金华市中心医院 呼吸内科，浙江 金华 321000;2.温州医学院 病理生理学教研室，浙江 温州325000;3.温州医学院附属第二医院 呼吸内科;4.温州医学院 电镜室

　　【摘要】 目的:探讨热休克蛋白27(HSP27)在肺缺血预处理保护中所起的作用及意义。方法：采用在体兔单肺原位缺血再灌注模型，30只日本大耳兔随机均分为三组：假手术(S)组、缺血/再灌注(I/R)组及缺血预处理(PC)组，实验检测肺组织湿干重比和肺泡损伤数比值，电镜评定肺组织超微结构损伤，免疫组化检测肺组织热休克蛋白27的定位及表达。结果：①I/R组肺组织湿干重比(W/D)及肺泡损伤数比值(IAR)明显于S组(均P<0.01);PC组W/D及IAR均显著低于I/R组(P<0.05或P<0.01)。②免疫组化显示PC组肺小动脉内膜及外膜层、肺小静脉壁全层、远端呼吸性细支气管及少许肺泡上皮HSP27有强表达;肺小静脉HSP27含量(平均吸光度值LD)高于I/R组和S组(均P<0.01)。③I/R组肺组织超微结构的损伤明显，而PC组损伤明显减轻。结论 ：肺缺血预处理能减轻肺缺血再灌注损伤，HSP27表达增加并参与肺缺血预处理保护。

　　【关键词】 热休克蛋白;兔;缺血预处理;缺血再灌注损伤

　　Heat shock protein-27 participated in the protection of lung ischemic preconditioning in rabbit TU Jun-wei*，XU Zheng-xie，WANG Wan-tie，Wu Cheng-yun， Fang Zhou-xi. *Department of Respi-ratory of Jinhua Central Hospital，Jinhua，321000

　　Abstract: Objective: To investigate the effect and significance of heat shock protein-27 in the protection afforded by lung ischemic preconditioning in rabbits. Methods: Single lung in situ ischemic reperfusion animal model was used. 30 rabbits were randomly divided into three groups: sham (S) group， ischemic/reperfusion (I/R) group and ischemic preconditioning (PC) group. Wet to dry ratio (W/D) and injured alveoli rate (IAR) were determined. Ultramicroscopic structural change was observed under electron microscope. Heat shock protein-27 was detected with immunohistochemistry. Results:①W/D and IAR in I/R group were higher than that in S group (P<0.01). The W/D and IAR in PC group were lower than that in I/R group (P<0.05， P<0.01 respectively). ②The heat shock protein-27 strongly expressed in intima and extima of small pulmonary artery，vessel wall of small pulmonary vein， respiratory brochiole and part of alveolar epithelium. The light density of heat shock protein-27 in small pulmonary veins in PC group was higher than that of other groups. ③Electron microscope showed serious lung injury occurred in I/R group while there was no significant injury in PC group. Conclusion: Lung ischemic preconditioning can mitigate lung ischemia reperfusion injury，highly expressed heat shock protein-27 participated in the protection afforded by lung ischemic preconditioning.

　　Key words: heat shock protein;rabbit;ischemic preconditioning;ischemia reperfusion injury

　　热休克蛋白(HSP)是一组结构上高度保守的多肽，能改变或修饰其他蛋白质，通过影响或调节其他功能性蛋白而间接发挥作用。近年有人发现肺缺血预处理能保护肺缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤[1-3]，但HSP27是否参与缺血预处理保护鲜见报道。本实验复制兔单肺原位I/R模型观察缺血预处理对肺缺血/再灌注损伤的干预，检测肺缺血预处理后HSP27在肺组织的定位、表达及其变化，探讨HSP27在肺缺血预处理保护中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 模型复制 雄性日本大白耳兔30只，体重2.0～2.5 kg，温州医学院实验动物中心提供。经耳缘静脉注射20%乌拉坦(5 mg/kg)麻醉，气管切开插管接动物呼吸机，吸纯氧，通气频率为30～40 次/min，潮气量双侧肺通气15～20 ml/kg，单侧肺通气8～10 ml/kg，呼吸比1:1.25。实验中予生理盐水维持输液，左胸第4及第5肋间开胸，左肺门游离后留置阻断带，静脉注射肝素抗凝。按Sekido等[4]方法复制在体兔肺I/R模型，即完全阻断左肺门血管和支气管一定时间后恢复其血供和通气。

　　1.2 实验分组 动物随机分三组。假手术组(S组，n =10)：左肺门游离后留置阻断带，但不进行阻断，观察150 min。缺血再灌注组(I/R组，n =10)：留置阻断带后观察30 min，继而阻断左肺门60 min后开放再灌注60 min。缺血预处理组(PC组，n =10)：留置阻断带观察5 min，阻断左肺门10 min后开放，续再灌注15 min(即缺血预处理)，以后操作同I/R组。

　　1.3 肺组织湿干重比测定 实验末取2 g左右左下肺组织称重为湿重，70 ℃烘箱烤24 h后称重为干重，计算出湿干重比(W/D)。

　　1.4 肺泡损伤数比值测定 左肺组织多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，每个标本5张切片，任取1张，光镜下观察10～15个视野(200倍)的肺泡总数，根据Murata等[5]方法计算肺泡损伤数，即肺泡中细胞总数(红细胞或白细胞)超过2个以上视为肺损伤，损伤的肺泡数与总的肺泡计数的比值为肺泡损伤数比值(IAR)。

　　1.5 HSP27的免疫组织化学检测 采用SABC法(兔抗HSP27多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司)。4%多聚甲醛固定的肺组织石蜡切片，3%过氧化氢室温处理10 min后，加正常山羊血清封闭，滴加一抗(1:50稀释)、二抗、SABC、DAB显色，阳性结果呈棕黄色。选取每只兔肺组织切片直径约25～150μm之肺小静脉5支，用免疫组化图像分析仪软件(华东理工大学研制)测取肺小静脉管壁平均吸光度值(LD)作为HSP27的相对含量。

　　1.6 肺组织电镜检查 实验末，每组取4例，在肺门横切面取1 mm×1 mm×1 mm大小肺组织2～3块，2.5%戊二醛预固定，1%锇酸后固定，常规脱水，包埋，超薄切片，常规染色，H-600型透射电镜观察。

　　1.7 统计学处理方法 多组样本均数比较进行方差齐性检验，采用单因素方差分析，两两比较采用q检验LSD法。

　　2 结果

　　2.1 各组肺组织湿干重比及肺泡损伤数比值的变化 表1显示，I/R组W/D及IAR明显高于S组(P <0.01);PC组W/D及IAR与S组比较差异无显著性(P >0.05)，但均低于I/R组(P <0.05或P <0.01)。

　　2.2 HSP27的免疫组化检测 S及I/R组近端支气管上皮及平滑肌有少量HSP27表达，肺小动脉及肺小静脉各层表达不明显。PC组肺小动脉内膜及外膜层、肺小静脉壁全层、远端呼吸性细支气管及少许肺泡上皮有较强表达(见图1①)，S组及I/R组上述部位无明显表达(见图1②及图1③)。PC组肺小静脉管壁HSP27LD为0.174±0.022，I/R组肺小静脉管壁HSP27 LD为0.128±0.017，S组肺小静脉管壁LD为0.121±0.011，经检验PC组肺小静脉管壁HSP27LD明显高于I/R组和S组(均P <0.01)。

　　2.3 肺组织超微结构 电镜下，PC组和S组肺组织超微结构损伤不明显(图2①、图2②)。I/R组肺组织表现出明显的损伤性改变，表现为肺细小动脉基底膜肿胀模糊，厚薄不均，基底部变窄，甚至断裂，内皮细胞线粒体肿胀(图2③)，部分内皮细胞呈拱桥状或高柱状向腔内突出，有脱落。肺细小静脉基底膜有断裂，不完整。毛细血管管腔可见多量中性粒细胞附壁现象，部分堵塞管腔。毛细血管内皮细胞吞饮小泡增多，线粒体肿胀，内皮连续性中断。

　　3 讨论

　　HSP27属低分子量热休克蛋白家庭成员，主要参与微丝的稳定和细胞信号转导，是机体内源性保护机制的重要成员之一。HSP27能阻止应激状态下肌动蛋白和微丝的分裂，有利于细胞骨架的稳定，它不仅对单个细胞产生应激耐受起重要作用，而且通过内皮和上皮的屏障作用，对整个机体起保护作用。

　　本实验显示，缺血再灌注损伤使肺组织湿干重比增加，肺泡损伤数比值增大，电镜下肺毛细血管的内皮细胞可见不同程度的超微结构损伤;缺血预处理干预后，肺组织损伤明显减轻，同时发现PC组HSP27较强表达在肺小动脉内膜及外膜层、肺小静脉壁全层、远端呼吸性细支气管及少许肺泡上皮，而S组和I/R组上述部位HSP27均无明显表达;因而推测缺血预处理后肺缺血再灌注损伤减轻与HSP27在上述部位表达增加并发挥其分子伴侣的保护功能有关。Hout等[6]报道，培养中华仓鼠肺细胞株CCL39过程中发现诱导细胞表达增加HSP27能使微丝稳定，防止氧化损伤。心肌的缺血预处理保护始于心肌的反复短暂缺血，且有研究发现，HSP27参与心肌缺血再灌注损伤的保护，多与其磷酸化形式有关[7-8]。在非心肌组织中，HSP27大多是以非磷酸化形式存在[9]，故本实验单次的肺缺血预处理即能使肺组织非磷酸化形式的HSP27表达增加，并减轻肺缺血再灌注损伤，似乎可以认为其作为终末效应子介导了肺缺血预处理保护，至于肺缺血预处理后瞬间HSP27高表达的机制及后继缺血再灌注损伤对其的影响仍需进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[9] Guay J, Lambert H, Gingras-Breton G, et al. Regulation ofactin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phos-phorylation of heat shock protein 27[J]. J Cell Sci, 1997,110 (Pt 3):357-368.