高浓度乙酸注射治疗兔VX2 肝肿瘤的实验研究

孙志远　丁仕义　黄学全　　【摘要】　目的　利用兔VX2 肝移植瘤模型探讨高浓度乙酸注射治疗肝肿瘤的价值,并探索注射治疗肝肿瘤的最适乙酸浓度。方法　用移植法建立兔VX2 肝肿瘤模型,将40 只携瘤兔随机分为A、B、C、D 四组。术前以CT 测量肿瘤直径。开腹向A、B、C、D 组肝肿瘤内分别注入50 %、75 %、100 %乙酸和生理盐水,48 h 后重复注射一次,术后一周处死兔子取肝脏观测比较各组肿瘤体积改变情况及坏死灶周围新生灶情况,并取肿瘤组织制作石蜡切片( HE 染色) ,镜下观察肿瘤组织坏死情况。结果　注射后一周各实验组肿瘤直径均减小,对照组肿瘤直径明显增大。100 %乙酸组10 例仅1 例在坏死灶周围发现新生灶,而50 %乙酸组发现5 例,75 %乙酸组发现7 例。镜下显示100 %乙酸组肿瘤中未坏死的肿瘤细胞团较75 %和50 %乙酸组少见。结论　高浓度的乙酸对兔VX2 肝肿瘤的灭活效果显著;其中100 %的乙酸效果最佳。　　【关键词】　肝肿瘤　　乙酸　　疾病模型,动物　　兔　　Acetic acid injection for the treatment of VX2 liver tumor by different concentration of acetic acid : an ex2perimental study in rabbit 　S un Zhi y uan , Ding S hi y i , Huang X uequan. Department of Radiology ,S outhwest Hos pi tal , Thi rd Mini tary Medical Uni versi t y , Chongqing 400038 , China　　【Abstract】　Objective 　To study the value of acetic acid injection for the t reatment of livertumor , and explore the best concent ration of acetic acid. Methods 　40 rabbit s with implanted VX2 liv2er tumor were randomly were divided into 4 groups. Before the t reatment , the diameter of the tumorswas acquired by CT. The abdomen was opened , and 50 % , 75 % , 100 % acetic acid or physiologic sa2line was injected into the tumors of A , B , C , D groups , respectively. Af ter 48 hours acetic acid wereinjected once at the same dosage. Af ter a week the rabbit s were killed and the livers were resected.The tumors’diameter were determined and the cases of the renascent tumors were counted in eachgroup . Some tumor tissues were sampled make paraffin section ( HE staining) and observe the necrosisof tumor tissue with microscope. Results 　1 week af ter injection , the average diameter of tumors ineach test group decreased when compared with the cont rol group. In 100 % acetic acid2group , only 1case had renascent tumors near the necrosis focus. In 75 % acetic acid2group , 5 cases had renascenttumors , and in 50 % acetic acid2group , 7 cases had renascent tumors. Under microscope , the survivaltumor cells in 100 % acetic acid2team were fewer than in 50 % acetic acid and 75 % acetic acid2group .Conclusions 　The effect of high concent ration of acetic acid injection for the t reatment of VX2 livertumor in rabbit is significant , and 100 % acetic acid has the best effect .　　【Key words】　hepatic neoplasms 　　acetic acid 　　disease models , animal 　　rabbit　　经皮乙酸注射治疗(percutaneous acetic acidinjection ,PAI) 肝癌的方法由日本学者Ohnishi于1994 年首先报道[ 1 ] 。该技术作为一种替代经皮无水乙醇注射治疗(percutaneous alcohol in2jection ,PEI) 肝癌的非血管性介入治疗方法,应用于临床后, 以其明显优于后者的疗效而越来越受到医学界的关注。但由于诞生时间不长,许多关键性的技术问题尚待进一步完善和规范。其中关于哪种浓度的乙酸治疗效果最佳的问题,一直存在争议。本研究采用兔肝接种VX2 肿瘤,以三种高浓度的乙酸用于肿瘤的灭活,从高浓度乙酸对肿瘤灭活的效果的角度来讨论其治疗价值,并探索用于注射治疗的乙酸的最佳浓度。1 　材料与方法1. 1 　实验动物　　VX2 种兔由第三军医大学新桥医院放射科赠送,其VX2 瘤株来源于重庆医科大学超声医学工程研究所。接种兔45 只,新西兰大白兔,体重2. 5～3. 0 kg ,雌雄不限,由本校动物所提供。1. 2 　试剂及仪器　　麻醉药采用2 %戊巴比妥钠。　　注射用乙酸采用成都科龙化学试剂厂生产的无水乙酸,50 %、75 %和100 %三种浓度的乙酸实验前即刻配制。　　采用Siemens 公司Sensation 16 型十六层螺旋CT 机进行扫描。采用欧乃派克非离子型造影剂进行增强。1. 3 　实验方法1. 3. 1 　肿瘤模型的建立　　采用开腹直视法种植兔VX2 肝肿瘤。先将大腿上携瘤的种兔麻醉(2 %戊巴比妥钠经耳缘静脉注射全麻) 、大腿部瘤区消毒、铺巾,切开肿瘤,取肿瘤边缘区颜色鲜嫩血供丰富的组织数片,将其剪成1 mm 大小组织块,浸泡在生理盐水中。将备种兔麻醉、备皮、消毒后,沿剑突下正中作一皮肤切口,沿腹白线切开腹壁、腹膜,轻轻拖出肝脏一叶,用眼科镊夹取一小块肿瘤组织,戳入肝脏,助手用无菌棉签轻轻压住,抽出眼科镊后,继续压迫数十秒至伤口止血。然后轻轻将肝脏回纳腹腔,缝合关腹。每个兔肝种植1～2 个瘤灶,每个肝叶最多种植一个瘤灶。　　种植后1～3 周内以CT 平扫和增强(3 mm 层厚) 观察肿瘤的生长情况,待肿瘤直径长到1 cm 左右(第15 天左右) 进行治疗试验。1. 3. 2 　乙酸注射治疗试验　　将40 只移植成功的携瘤兔随机分为4 组,每组10 只,其中A 组为50 %乙酸治疗组,B 组为75 %乙酸治疗组,C 组为100 %乙酸治疗组,D组为生理盐水对照组。各浓度乙酸实验前配制。　　实验前经CT 平扫和增强测量肿瘤直径。　　采用无菌操作下开腹注射治疗。暴露肝脏后,可摸到肝脏肿块,质硬,略突出于肝表面。用1 ml 注射器分别向A、B、C、D 组肿块内注入浓度为50 %、75 %、100 %的乙酸和生理盐水(均混入少许造影剂) ,注射的量以乙酸弥散的范围完全覆盖并超出肿块边缘5～10 mm 为准,乙酸弥散的范围可通过肝脏颜色变黑的范围和CT 平扫所见造影剂弥散范围来确定。乙酸注射的速度要慢,约(0. 1～0. 3) ml/ min ,以免乙酸因压力过高返流;当返流明显难以继续时,可适当变换进针位置。拔针后用纱布压迫穿刺点数分钟,待血液和返流的乙酸不再溢出为止。然后关腹,肌注庆大霉素抗感染。48 h 后再次开腹,用与第一次注射浓度相同的乙酸对肿瘤作第二次乙酸注射,乙酸弥散的范围与上次注射相同。再次关腹,待实验兔继续生长。　　第二次注射后第7 天处死实验兔,取出肝脏,沿肿瘤中线切开,观察肿瘤组织坏死情况及其周围新生灶情况。然后将肝脏标本用福尔马林液固定后,取出标本,将坏死灶所在区域切成3 mm 厚薄片若干,再次观察复核新生灶情况,并用游标卡尺测量瘤灶、坏死灶及新生灶大小。取肿瘤原发灶和新生灶做成石蜡切片,HE 染色后镜下观察肿瘤坏死情况,并确认新生灶是否为肿瘤组织。1. 4 　统计学处理　　根据大体标本观测结果统计各浓度组术前术后肿瘤平均直径、新生灶例数、新生灶平均直径,利用统计软件SPSS12. 0 ,采用完全随机分组设计的单因素方差分析比较术后肿瘤直径的组间差异。2 　结果2. 1 　大体标本观察　　肝脏坏死区域呈黑褐色,边界清楚,其边缘有一灰白色薄带,为炎性浸润带。肿瘤位于坏死灶中央,质地较硬,呈灰白色,色泽暗淡,与治疗前色泽鲜亮的鱼肉状不同。其中A 组10 例有7 例在坏死灶周围发现新生灶,B组10 例有5 例发现新生灶,C 组10 例仅1 例发现新生灶。新生灶位于坏死灶边缘或附近地带,呈结节状或带状分布,色泽鲜亮,质地较硬,呈鱼肉状。各乙酸组大体标本见图1～3 。各组治疗前后瘤灶缩小情况见表1 。3 　讨论　　自1994 年Ohnishi 报道用PAI 的方法治疗肝癌以来,国内外已有诸多临床研究和动物实验证明该方法优于PEI[2 ,3 ] 。因此,PAI 被认为是治疗肝癌的一种很有前途的非血管介入治疗方法。但由于诞生时间不长,许多技术细节有待完善。　　关于肝癌的PAI 治疗的适宜乙酸浓度问题,国内外一直存在不同意见,造成临床应用中选用的乙酸浓度不统一甚至混乱的现象。　　Ohnishi 的早期动物实验[1 ] 发现15 %～50 %的乙酸引起的大鼠肝脏坏死灶直径随浓度的增大而增大比较明显,而50 %以上浓度的乙酸引起的坏死灶直径随浓度增大的幅度明显减小,因此认为50 %的浓度是乙酸治疗肝癌的适宜浓度。因而临床上很少采用高于50 %浓度的乙酸用于治疗。但是国内外有学者对此提出了不同看法。吕国荣等曾提出75 %的乙酸浓度为最适浓度[4 ] 。　　以上学者在探讨这个问题时都是以乙酸造成的肝脏坏死灶大小来评价乙酸的不同浓度应用于PAI 的效果的。笔者认为,选用适宜的乙酸浓度,应着眼于对肿瘤的灭活达到最大效应,即对肿瘤造成的坏死最彻底(但不至于造成严重的副反应) 。而造成坏死的范围,完全可以通过调节所注射乙酸的量来控制。至于50 %以上浓度的乙酸引起的坏死灶直径随浓度增大的幅度明显减小的现象,我们认为这是溶质扩散的物理现象,因为半径与体积成立方根关系,那么一定浓度以上的乙酸引起的坏死灶直径随浓度增大的幅度减小是必然的,如果以浓度对坏死灶体积作曲线,则得到的就是线性关系。根据以上实验现象把50 %以上浓度的乙酸排除在治疗浓度范围以外显然是不能令人信服的。因此,本实验试用高于50 %浓度的乙酸于兔VX2 肝肿瘤,观察对比其对肿瘤的灭活效应,以证明更高浓度的乙酸的治疗效果优于50 %乙酸。　　我们发现术后1 周坏死灶附近的肿瘤新生灶几乎总是发生在肝脏坏死灶的边缘或附近,推测其原因可能是较低浓度的乙酸弥散到边缘带时其浓度已稀释至极低,难以杀死该处潜在的肿瘤细胞微灶;如果注射的乙酸初始浓度很高,当其弥散到外围时就可保持一定的浓度,对肿瘤细胞微灶仍具有杀伤力,从而减小了新生灶生成的可能。　　Ohnishi[5 ] 曾经下结论说单次注射乙酸是不可能治愈肝癌的,因为乙酸溶解胶原需要几小时到一天的时间,在此实验之前我们曾做过一部分单次注射的预实验,结果与此理论相一致,因为我们所有单次注射的个例, 乙酸浓度从15 %～100 % ,注射后一周坏死灶附近均发现了新生灶。故我们在正实验中采用二次注射治疗。从实验结果来看,二次注射实验的效果明显较一次注射实验效果好,且更能显现不同浓度乙酸治疗效果的差异。　　从以上结果我们可以看出,从对肿瘤的灭活效果的角度出发,100 %的乙酸应该是治疗肝癌的最佳浓度。它造成肿瘤一定程度坏死所需注射次数最少。如果增加注射次数,相信较低浓度的乙酸也可能导致肿瘤相应程度的坏死,但是从技术的角度讲,我们认为还是应该尽量减少注射次数,因为注射次数增加,就意味着患者承受痛苦的增加和疗程的延长。　　不过,100 %的乙酸究竟能否应用于临床,还需进一步探讨。国内外学者最担心的一个问题,就是乙酸的肾毒性,因为根据以往的文献报道,乙酸有肾功能损害的作用,而且临床上有一次性大剂量高浓度(50 %) 的乙酸注射导致肾功能衰竭需血液透析治疗的报道[6 ] ,因而更高浓度的乙酸应用于临床应当非常慎重。但是,从理论上探讨,我们认为肝脏注射乙酸对肾功能的损害程度应该只与注射的乙酸的溶质的量有关,而与乙酸浓度关系不大,因为乙酸是入血液后经血循环到达肾脏的,在此过程中已经稀释,与注入肝脏的乙酸浓度已无太大关系。实际上,在实验中我们观察到,乙酸浓度越高,其弥散能力越强,覆盖肿瘤所需乙酸剂量越小,因而一次注入的总溶质的量比低浓度乙酸不会有太大增加;而且利用高浓度的乙酸治疗,可以减少注射次数,因而在一个疗程中注射的总的溶质的量可能不会增加反而有可能减少。　　总之,根据本次实验结果我们认为,高浓度的乙酸对兔VX2 肝肿瘤的灭活效果是非常显著的;其中100 %的乙酸效果最佳。　　参考文献[1 ] Ohnishi K, Ohyama N , Ito S , et al . 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