呼吸机相关肺炎病原菌分布及耐药性分析

呼吸机相关肺炎病原菌分布及耐药性分析王 　煜1 , 李振华1 , 刘 　兵2  , 侯显明1 ,于润江1(1 .  中国医科大学附属一院呼吸疾病研究所 , 辽宁 沈阳 110001 ; 2 .  中国医科大学微生物教研室 , 辽宁 沈阳 110001)摘要 : 目的 　研究呼吸机相关肺炎 ( VA P) 病原菌来源 、分布特点及医院内产超广谱β2内酰胺酶 ( ESBL s) 细菌的流 行特征 。方法 　对机械通气患者下呼吸道分泌物进行细菌定量培养及抗菌药物敏感性测定 ;对产 ESBL s 细菌进 行检测及质粒酶切图谱分析 。结果 　VA P 病原菌以 G-  杆菌为主 ,检出产 ESBL s 细菌 9 株 ,均不同程度表现为多 重耐药 ;其中 5 株来源于 R ICU 产 ESBL s 肺炎克雷伯菌 ,经质粒酶切图谱分析证实为同一克隆起源 。结论 　VA P 主要是由 G-  杆菌引起 ,耐药率普遍较高 ,质粒在耐药菌的传播中起重要作用 。关键词 : VA P ; 病原菌 ;  ESBL s ; 耐药质粒特征  Distribut ion an d Drug2resistance  of  Pathogens in Pat ients  with Vent ilator2a ssoc iated Pneumon iaWAN G Yu1 , L I Zhen2hua1 , L IU Bing2 , HOU Xian2ming1 ,  YU Run2jiang1 ( 1 .   I nst i t u te of  Res pi rat ory Diseases ,  t he  Fi rst  Hos pi t al , 2 .   De p a rt m en t of  M ic robiol ogy ,  Chi n a M edical  U ni ve rsi t y ,  S hen gy a n g 110001 ,  Chi n a) Abstract : OBJECTIVE To investigate t he p revalence and t he changes in drug2resistance of pat hogens in patient s wit h ventilator2associated p neumo nia  ( VA P ) .   METHODS  The  secretio n  of  lower  respiratory  t ract  of  patient s  received mechanical ventilatio n or  t racheosto my for  more  t han  48  hours  was cult ured  wit h  a quantitative  met hod  and  t heir antibiotic  suscep tibilit y  was  detected  wit h  disk  diff usio n  met hod.   At  t he  same  time , plasmid2mediated  extendedspect rumβ2lactamases ( ESBL s)  were measured by E2test , and t he epidemiology of  ESBL s pat hogens was investigated using plasmid  rest rictio n  endo nuclease  fingerp rinting.   RESUL TS  The  main pat hogens in  VA P  were  Gram2negative bacilli ( GNB) .  Nine of 36  GNB p roduced ESBL s , and exhibited a multidrug2resistance. Plasmid rest rictio n endo nuclease analysis p roved t hat plasmid fingerp rintings of five  Klebsiel l a p neu m oni ae st rains p roducing ESBL S f ro m R ICU were t hesame t ype.  CO NCL USIO NS GNB are still t he most important pat hogens in VA P and have resistant to antibiotics.  The t ransferable plasmids play a major role in t he sp read of t he drug resistant bacteria .Key words : VA P ; Pat hogen ;  ESBL s ; Drug resistant plasmid p rofile　　呼吸机相关肺炎 ( VA P) 是机械通气患者常见的并发症和重要的致死原因 ,其病原菌多为难治性 , 并对抗菌药物有较高的耐药性 ,为了明确 VA P 病原 菌的来源及分布特点 ,掌握医院内产超广谱β2内酰 胺酶 ( ESBL s) 细菌的流行特征 , 对我院 R ICU 和 S ICU 病房 76 例机械通气患者下呼吸道病原菌 , 做 了检测及质粒酶切图谱对产 ESBL s 细菌进行监测分析 ,现将结果报告如下 。1 　对象与方法1 . 1 　研究对象 　选择 R ICU 和 S ICU 病房机械通气的 76 例病例 ,男 54 例 ,女 22 例 ,年龄 13～92 岁 ,平均年龄 (59 . 93 ±18 . 02) 岁 ,其中发生 VA P 39 例 ,基础疾病为慢性阻塞性肺炎 、急性呼吸窘迫综合征 、 支气管哮喘 、外伤 、脑血管意外 、恶性肿瘤 、急性坏死 型胰腺炎等 。VA P 诊断标准参照 1999 年中华医学 会呼吸病学分会制定的医院获得性肺炎诊断和治疗 指南 (草案) 1     ,VA P 诊断标准 : (1) 使用呼吸机 48 h后发病 。(2) 与机械通气前胸片比较出现肺内侵润 阴影或显示新的炎性病变 。( 3) 肺实变体征和 ( 或) 湿性 音 , 并具有下列条件之一者 : ①血 WBC >1010 ×109 / L 或 < 4 ×109 / L ,伴或不伴核左移 ; ②体 温 > 37 . 5 ℃,呼吸道有脓性分泌物 ; ③起病后从支气管分泌物中分离到新的病原体 。1 . 2 　标 本 的 采 集 　采 用 保 护 性 双 套 管 标 本 刷( PSB) 采集下呼吸道分泌物 ,自患者行气管插管 ( 或 切开) 之日 ,立即行 PSB 刷采样做细菌学检查 ,以后 每隔 2～3 日采集 1 次 ,直至出现肺部感染 、患者死 亡 、病情好转 、封闭气管切口或拔管时为止 。1 . 3 　细菌培养及分离鉴定 　下呼吸道标本以四区 划线法接种于血平板和麦康凯平板内 ,作细菌定量 培养 ,采用法国 A P I 系统鉴定 。1 . 4 　ESBL s 检测 　(1) 筛选试验 :采用纸片扩散法 ,判定依据 1999 年 N CCL S 标准 ,抑菌环直径头孢他 啶 ≤22 mm 、头孢曲松 ≤25 mm 、氨曲南或头孢噻肟≤27 mm ,至少符合两项指标 , 高度怀疑 ESBL s 菌 株 。(2) 确定试验 : 采用 Etest 方法 , 如果头孢他啶 与头孢他啶/ 克拉维酸对耐药菌 M IC 比值 ≥8 ,即认 定耐药菌产生了 ESBL s 。1 . 5 　细菌质粒特征分析 　细菌质粒提取采用美国Pro mega 公司质粒提取试剂盒 , 具体操作按试剂盒 说明进行 , 选用 Hind Ⅲ限制性内切酶对其进行酶切 ,以 Hind Ⅲ酶切 L ambda DNA 为标准 ,0 . 8 %琼脂糖凝胶电泳 ,观察结果 。1 . 6 　统计学分析 　计量资料 ,用 ?x  ±s 表示 ,计数 资料 ≥2 个总体率的比较用 χ2 检验 , P < 0 . 05 为差异有统计学意义 , P < 0 . 01 为差异有显著性 。2 　结 　果2 . 1 　病原菌分布 　在 76 例机械通气患者中 ,有 39例 PSB 标本分离培养出具有诊断意义 ( 纯菌浓度≥103  CFU / ml) 的细菌 ,21 例在治疗中重复 PSB 检抗菌药物药敏试验结果 ,总的耐药率较低的依次为亚胺培南 ( 11 . 1 %) 、头孢哌酮/ 舒巴坦 ( 22 . 2 %) 、环 丙沙星 、阿米卡星 (33 . 3 %) 、头孢他啶 (47 . 2 %) 。耐 药率较高的有头孢呋辛 (91 . 7 %) 、头孢噻肟 (75 %) 、 氨曲南 (72 . 2 %) ,其他β2内酰胺类抗菌药物耐药率 都 > 60 % (表 2) 。表 2 　36 株 G-  杆菌对 10 种抗菌药物总的耐药率比较2 . 2 　抗菌药物敏感性测定 　36 株 G-  杆菌对常用抗菌药物药敏试验结果 ,总的耐药率较低的依次为亚胺培南 ( 11 . 1 %) 、头孢哌酮/ 舒巴坦 ( 22 . 2 %) 、环 丙沙星 、阿米卡星 (33 . 3 %) 、头孢他啶 (47 . 2 %) 。耐 药率较高的有头孢呋辛 (91 . 7 %) 、头孢噻肟 (75 %) 、 氨曲南 (72 . 2 %) ,其他β2内酰胺类抗菌药物耐药率 都 > 60 % (表 2) 。2 . 3 　产 ESBL s 株组与非产酶株组耐药比较 　产酶 株组对三代头孢中头孢他啶 、头孢哌酮 、头孢噻肟耐 药 率 比 非 产 酶 株 组 明 显 增 高 , 耐 药 率 分 别 为8819 % 、100 % 、100 % , 经 χ2  检验差异有非常显著( P < 0 . 001) ,产酶株组对环丙沙星的耐药率亦比非 产酶株组明显增高 ,耐药率为 77 . 8 % ,差异有显著 性( P < 0 . 01) ,但产酶株组对头孢西丁及哌拉西林/ 他唑巴坦耐药率较低 ,分别为 22 . 2 % 、11 . 1 % ,对亚 胺培南无一耐药 (表 3) 。表 3 　产超广谱酶株组与非产酶株组的耐药率 ( %) 比较2 . 4 　质粒限制性内切酶分析 　将 7 株产 ESBL s 肺 炎克雷伯菌作限制性内切酶分析 ,结果发现 5 株来 源于 R ICU 菌株被切成相同数目 、长度的 DNA 片 段 ,显示了很高的同源性 , 提示 R ICU 可能存在产 ESBL s 肺炎克雷伯菌医院感染的流行 ,且为同一克 隆起源 。其余 2 株分别来源于 S ICU 和干诊病房 ,显示各自不同的酶切图谱 ,呈散发状态 (图 1) 。3 　讨 　论3 . 1 　VA P 发病概况 　在我国院内获得性肺炎发病 率已 上 升 到 23 . 3 % ～ 42 . 0 % , 居 医 院 感 染 的 首 位2     ,其中 VA P 作为机械通气患者常见的严重并 发症 ,国外报道其发病率达 9 %～70 % , 比未接受 MV 患者高 13～15 倍 ,而耐药菌株又不断增加 ,使 VA P 死 亡 率 高 达 50 % ～ 70 %3     , 我 院 R ICU  和 S ICU 中其发生率为 51 . 3 % ,病死率为 43 . 6 % ,所以 如何防治 VA P ,提高危重患者抢救成功率 , 已成为 呼吸界关注的热点之一 。3 . 2 　产 ESBL s 细菌感染的危险因素 　( 1) 宿主因 素 　本组 9 例产 ESBL s 细菌感染患者均为老年人 , 平均年龄 67 . 9 岁 ,身体主要器官功能退化 ,生理防 御机能衰退 , 多合并基础病 ( CO PD 、肿瘤 、糖尿病 等) 。(2) 环境因素 　Tenover 等强调环境条件往往 促使耐药基因突变 ,出现新的表型 ,而且起着关键性 作用 。(3) 介入因素 　与机械通气有关 ,气管插管破 坏了会厌部的正常屏障 ,削弱了咳嗽反射和纤毛运 动 ,降低了上呼吸道的防御功能 ,使鼻咽部细菌随着 导管气囊周围潴留分泌物的淤积和下漏进入支气管 肺组织造成感染 ,同时 ,肺具有丰富血液 ,储存骨髓 以外 1/ 3 中性粒细胞以及分泌多种强活性的细胞因 子 ,如 TN Fα和 IL21β都利于炎症扩散4     。( 4) 抗菌 药物因素 　所有产 ESBL s 细菌感染患者在分离细 菌之前都使用过三代头孢菌素 ,尤其是头孢他啶及 头孢 噻 肟 , 说 明 广 谱 抗 生 素 的 使 用 是 细 菌 产 生 ESBL s的重要选择因素 。( 5) 致病菌因素 　由于产ESBL s 菌可由质粒携带 ,质粒具有可传递性 ,可通过接合 、转化 、转导等方式在不同菌株 、菌种或菌属间 转移扩散 ,因而导致对抗菌药物耐药细菌的广泛传 播 。3 . 3 　VA P 病原菌及耐药性 　本研究应用 PSB 对76 例机械通气患者下呼吸道分泌物进行细菌监测 , PSB 培 养 结 果 显 示 , VA P 病 原 菌 多 为 G-   杆 菌(9213 %) ,且种类较多 ,与院外感染有很大不同 ,其 中以铜绿假单胞菌 、肺炎克雷伯菌最常见 ,其次为大肠埃希菌 , 与文献报道相近5     。近年来 G+  菌在 ICU  获 得 性 感 染 中 比 例 明 显 上 升 , 尤 M RSA , M RCN S ,本研究分离 M RSA 1 株 ,M RCN S 2 株 。VA P 病原菌大多数对各类抗菌药物呈不同程 度耐药 ,特别合并 CO PD 患者 ,其下呼吸道 G-  杆菌耐药者居多 ,其中以铜绿假单胞菌 、不动杆菌属和肠 杆菌属耐药尤为严重 。从表 2 可见 G-  杆菌对 10 种 常用抗菌药物的耐药情况 ,总的耐药率由低到高依 次 为 亚 胺 培 南 ( 11 .  1 %) 、头 孢 哌 酮/ 舒 巴 坦(2212 %) 、环丙沙星 、阿米卡星 ( 3313 %) 、头孢他啶(47 . 2 %) , 其 他β2内 酰 胺 类 抗 菌 药 物 耐 药 率 都> 60 % ,可见 VA P 耐药率普遍较高 。3 . 4 　G-  杆菌耐药机制 　近年来研究发现 ,导致细 菌对β2内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因是细菌质粒介导的 ESBL s 产生 。ESBL s 主要来源于 T EM 和SHV 系列 ,是β2内酰胺酶 T EM21 、T EM22 和 SHV21 基因单个或多个点突变 ,从而导致一个或多个氨基 酸改变而来 ,耐药基因位于酶的活性中心附近 ,可能 产生酶和受体结合的新模型 ,其主要特点是水解青 霉素类 、头孢菌素类及单环类抗生素 ,因其作用底物广泛 ,被称为超广谱β2内酰胺酶 。随着三代头孢类 药物在医院和社区的广泛使用 ,产 ESBL s 细菌在临 床标本分离率有增加趋势 。本组对 36 株 G-  杆菌 进行 ESBL s 的检测 , 检出产 ESBL s 细菌 9 株 , 占25 % ,主要由肠杆 菌 科 细 菌 产 生 , 与 文 献 报 道 相 同6     。3 . 5 　产 ESBL s 细菌医院感染的暴发流行 　本组检 出 7 株产 ESBL s 肺炎克雷伯菌 , 5 株来源于 R ICU 患者 ,集中出现在 1999 年 11 月～2000 年 2 月期 间 ,相隔时间较近 ,且有相似的耐药谱 ,同一克隆株 在空间分布上的集中趋势 ,推测 R ICU 可能存在交叉传播或通过尚未识别的共同传染源传播 。为证实 其同源性 ,我们作了质粒酶切图谱分析 ,结果 5 株细 菌显示极为相似的酶切图谱 , 说明造成本次 R ICU 流行为同一克隆起源 。Q uinn 等6    对美国 3 次产 ESBL s 细菌的流行进行分析后得出 ,抗生素有明显的选择性压力 。Pena 等7    在一次 ICU  ESBL2Kp 暴 发期间对所有患者便中致病菌作了调查 , 认为在 ESBL2Kp 流行的环境中 ,利于交叉感染的一些操作 如尿道插管 、机械通气等 ,与感染最为相关 ,且在住院过程中危险性增加 。因此 ,加强消毒隔离措施 ,严 格遵守无菌操作规程和屏障护理 ,亦是减少医院感 染的一个重要渠道 。参考文献 :1   中华医学会呼吸病学分会.  医院获得性肺炎诊断和治疗指南( 草案) S .中华医学会呼吸病学分会 ,1998 .  12215 .2   胡东升 , 常同软.  医院感染基本理论与研究方法M .    郑州 :河南人民出版社 , 1994 .  42 .3   Cro uch BS , Wunderink R G , Jo nes CB , et al .  Ventilato r2associat2ed p neumo nia due to  Pseu donom as aer u gi nosa J .  Chest , 1996 ,109 ( 4) : 101921029 .4   Slut sky AS ,  Treamblay L N .  Multiple  system o rgan failure :  is mechanical  ventilato r a co nt ributing facto r J .  Am  Rev  Res   pir Dis , 1998 , 157 : 172121728 .5   Gunseren F , Mamikoglu L , Ozt ur k S , et al .  A surveillance st udyof   Gram2negative  bacteria  isolated  f ro m  intensive  care  unit s in eight ho spitals in Tur keyJ . 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