变色培养法检测结核分枝杆菌耐药性的研究
发表时间：2009-06-18 浏览次数：830次
作者:石国民,易树君
【摘要】 目的 建立一种快速、廉价、方便的结核分枝杆菌药敏方法，缩短结核分枝杆菌药敏试验时间。方法 采用变色培养法与绝对浓度法对照实验，验证新方法的灵敏度和特异性。结果 两试验可比性好，特异性为100%，新方法比传统绝对浓度法平均缩短时间2～3周。结论 变色培养法优于传统绝对浓度法，适用于在基层推广。
关键词 分枝杆菌 结核 药敏 变色培养
随着化疗药物的临床应用，全球耐多药结核病日趋严峻，给结核病的防治带来很大的困难。根据2000年世界卫生组织来自52个国家的结核耐药监测报告显示 ［1］ :临床结核病中1.8%的病例为多药耐药，11.1%的病例为单药耐药。我国2000年第四次结核病流行病学抽样调查―结核分枝杆菌耐药性分析结果显示 ［2］ :总耐药率为27.8%，耐多药为10.7%。目前结核分枝杆菌药敏检测试验的方法很多，如绝对浓度法、比率法、BACTEC9600、基因检测等。但这些方法有的时间长，有的费用高，有的技术复杂，很难满足临床需要。本研究根据大部分结核分枝杆菌（99%）能分解硝酸盐的原理，试图寻求一种快速、廉价、方便的结核分枝杆菌药敏试验方法。
1 材料与方法 1.1 材料 所有实验菌株来源于本院从结核病人分离的临床菌株，标准株H37Rv、H37Ra，由北京市结核病胸部肿瘤研究所惠赠。利福平（RFP）编号9910008，纯度93.00%。异烟肼（INH）编号990820，纯度99.37%。含硝酸钾及含不同浓度RFP的L―J培养基自配。显色剂:50%HCL，0.2%磺胺，0.1%N-萘基乙二胺盐酸盐。
1.2 方法 1.2.1 筛选菌株 用绝对浓度法筛选耐RFP（50mg/ml;250mg/ml）、耐INH（1mg/ml;10mg/ml）临床菌株，收集敏感菌株及H37Rv。 1.2.2 培养基 配制含有硝酸盐，同时含有以上各浓度抗生素或不含抗生素的L-J培养基。 1.2.3 待测菌制备 取待测细菌，碾碎，PBS溶解。麦氏管比浊配成10～20mg/ml细菌原液。取300μl于另一灭细管中5倍稀释。 1.2.4 痰标本接种 取不含抗生素的控制管3支，接种0.1ml稀释菌液于控制管中;取含抗生素管各1支，接种0.1ml原液于各抗生素管中。或用1N的NaOH处理后的痰标本直接接种。 1.2.5 药物敏感性 37℃培养7天，取控制管加入0.5ml显色剂，如阴性，加入锌粉后阳性，表示无菌生长，继续培养。如阳性，或者阴性加锌粉后仍阴性，表示有菌生长，则各抗生素各加0.5ml显色剂，阳性的记录结果，阴性的加入锌粉阴性，归阳性结果，表明耐药。阴性的加入锌粉阳性，才为阴性结果，表明对药物敏感。 1.2.6 重复操作 10天，14天后，分别取另一支控制管重复步骤4操作，如控制管仍无菌生长，放弃此管试验。 2 结果
我们用变色法、绝对浓度法检测8株耐RFP（50mg/ml），31株耐RFP（250mg/ml），22株敏感的结核分枝杆菌（见表1）。结果表明8例低耐、31例高耐利福平，两种方法均表现一致，22例敏感株，有1例呈现高耐现象。所有结果均在第7天观察到结果。阴性管中加入锌粉，试管变色，表明无亚硝酸盐分解为氮氧化物。 表1 耐利福平结核分枝杆菌变色法、绝对浓度法分析（略） 笔者用变色法、绝对浓度法检测22株耐INH（1mg/ml），13株耐INH（10mg/ml），22株敏感的结核 分枝杆菌（见表2）。结果表明22例低耐、13例高耐异烟肼，两种方法均表现结果相同，22例敏感株，有2例呈现低耐药现象。53例在第7天观察到结果，4例在第4天观察到结果。阴性管中加入锌粉，试管变色，表明无亚硝酸盐分解为氮氧化物。 表2 耐异烟肼结核分枝杆菌变色法、绝对浓度法分析（略） 3 讨论
绝对浓度法为传统的结核分枝杆菌药敏试验方法，在我国自1963年推广使用以来，几经修改，一直作为常规药敏方法，具有很好的代表性。本研究用绝对浓度法作为对照试验，探讨变色培养药敏方法的可行性。结果表明:变色培养法对耐利福平、耐异烟肼二药的特异性都达到了100%，灵敏度分别为对利福平低耐为100%、高耐为96.9%，对异烟肼低耐为91.7%、高耐为100%。经χ 2 检验两试验差异无显著性，试验结果具有一致性。 绝对浓度法观察结果的时间为4～8周，而变色培养法观察结果的时间为1～2周，研究中的99个菌株绝对浓度法均在第4周以后才能观察到结果，变色培养法95株第7天观察到结果，4株第10天观察到结果。可见变色培养法比绝对浓度法早2～3周观察到结果。 变色培养法是利用结核分枝杆菌分解硝酸盐的原理而设计的，据文献报道 ［3］ :有<1%的结核分枝杆菌如牛型结核分枝杆菌不分解硝酸盐。本试验中有1例因控制管阴性而认为无效而放弃，究竟是牛型结核分枝杆菌还是菌量过少的原故，有待考证。结核分枝杆菌分解硝酸盐为亚硝酸盐，同时亚硝酸盐也能继续分解为氮氧化物 ［3］ 。因此在阴性管中必须加锌粉以校正其结果，但本试验无一例生成了氮氧化物，可以肯定至少前10天亚硝酸盐不会分解成氮氧化物。 总之，变色培养法是一种迅速、廉价、方便的结核分枝杆菌药物敏感试验方法，但在应用于临床之前，此种方法的准确性和重复性还需要更进一步的研究，深信此法将在临床上有很好的应用前景。
参考文献 1 Angeby KAK，Klintz L，Hoffner SE.Rapid and Inexpensive Drug Suscepˉtibility Testing of Mycobacterium tuberculosis with a Nitrate Reductase Assay.J Clin Microbiol，2002，40（2）:553-555.
2 刘宇红，姜广路，赵立平，等.第四次全国结核病流行病学抽样调查-结核分枝杆菌耐药性分析与评价.中华结核与呼吸杂志，2002，25（4）:224-227. 3 Warren NG，Body BA，Dalton HP.An improved reagem for mycobacteriˉal nitrate reductase tests.J Clin Microbiol，1983，18（3）:546-549.
