改良型大鼠梗阻性黄疸肝切除术后肝衰模型的建立

由肝内或肝门部病变所致梗阻性黄疽的患者,治疗时往往需要手术切除部分肝脏,尤其是恶性肿瘤,只有行根治性切除才能获得最佳疗效,而术后肝功能代偿的能力一般认为取决于2个因素,一为剩余肝脏的体积,为剩余肝脏的好坏.在临床工作中我们发现此类患者术后易发生急性肝衰竭,由此我们提出建立一种病理生理机制相似的动物模型来研究术后急性肝衰竭的治疗方法.我们将本实验分为梗阻性黄疽模型的建立与选择、肝衰模型的建立及验证2部分,旨在建立一种存在于梗阻性黄疽基础上进行部分肝切除诱导急性肝衰竭的动物模型,为进一步治疗奠定基石出.    材料与方法    1.材料:清洁级雄性Vista:大鼠,体质量250-300g,购自湖北省疾病防治控制中心动物研究中心.饲养于恒温、清洁环境,喂标准饲料,维持12h昼夜节律.遵守实验动物使用及管理原则.术前禁食12h,不禁水.    2.梗阻性黄疽模型制作:取健康雄性Cristar大鼠40只,随机分为4组:假手术对照组(Sham组)、梗阻性黄疽7d组(7d组)、梗阻性黄疽14d组(14d组)、梗阻性黄疽21d组(21d组),每组10只.以10%水合氯醛0.3ml/100g给予腹腔麻醉,取剑突下正中切口进腹,游离出部分胆总管,用3-0丝线双重结扎切断胆总管.Sham组仅游离胆总管而不予结扎切断.全层间断缝合关腹,皮下注射青霉素40万U预防感染.    3.梗阻性黄疽模型观察、标本采集及检测:术后观察大鼠精神、大小便颜色、生存率等一般情况分别在手术后大14,21d开腹观察腹腔一般情况,包括腹腔内炎症、脏器颜色、腹水颜色及浑浊度,观察肝脏大体改变取下腔静脉血,分离出血清,在武汉大学人民医院检验科行丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(SST)、总胆红素(TBIL)的检测采血后取大鼠肝脏左叶同一位置肝组织,立即置于4%多聚甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋切片,行苏木素一伊红(HE)染色.    4.肝衰模型的制作:在前面实验结果的基础土,选择胆总管梗阻14d后进行第2次手术造模取健康雄性Wistaa}大鼠109只,随机分为4组:米缺血组(0min组,13只)、缺血15rein组(15min组,15只)、缺血30min组(30min组,19只)、缺血45min组(45min组,22只),按前述方法制作梗阻性黄疽模型,梗阻14d}14d后以10%水合氯醛0.2,n1/100u给予腹腔麻醉,原切L-a进腹,暴露出膨大胆位、管,在胆总管前壁用7-0带针丝线作荷包缝合,插入预先准备好的硅胶管(长3cm,内径1mm,外径2nmi),系紧荷包线,根据情况适当加针一缝扎固定,硅胶管的另一端留置作十二指肠胆汁内引流游离肝脏的左叶和中叶(约占全肝70%),除0min组外各实验组用小号无损伤Ill管夹阻断其脉管,保留剩下的肝右叶和尾叶(约{污全肝30}/c)作为门静脉与腔静脉血液回流通道,川访止门静脉和胃肠道淤血二分别阻断血供15,30,45min后再次进人腹腔移去血管夹,恢复阻断区血供,同时切除未经缺血处理的肝叶,建立肝切除肝缺血损伤模型将硅胶管另一端插人十二指肠腔内,荷包缝合固定冲洗腹腔,并注射5%的葡萄糖2ml,全层间断缝合关腹.皮下注射青霉素40万L预防感染_剔除死亡大鼠,保证采血时每组有10只大鼠存活.    5.肝衰竭模型观察、标本采集及检测:术后观察大鼠一般情况,分别在手术后6h开腹观察腹腔一般情况,肝脏大体改变.每组中有10只用于观察生存率二其余大鼠于术后6h取下腔静脉血,分离出血清,在武汉大学人民医院检验科行ALT,AST,TBIL的检测采血后取大鼠肝脏左叶同一位置肝组织,行HE染色6.统计学方法:结果用均数*标准差:表不两组间采用成组资料f检验,多组间比较采用单因素方差分析,应用SPSS18.0统计软件分析.    结果    1.梗阻性黄疽模型;(1)一般情况:与假手术组大鼠比较,随着梗阻时间延长,大鼠精神变差,腹腔内炎症加重,肝脏色泽加深,腹水增多,一般情况恶化,7,14,21d3组t}大仲颜色变浅(2)生存率:随着胆道梗阻时间的延长,大鼠的生存率逐渐降低.假手术组21d生存率为100%,7d组7d生存率为90%,14d组14d生存率为80%,21d组21d生存率仅为40%.    死亡的大鼠经解剖发现死亡原因多为腹腔感染,大量腹水(3)肝生化:各组存活的大鼠血清ALT,AST,TBIL检测结果见表1.随着胆管梗阻时间的延长,肝脏损伤逐渐加重,总胆红素水平逐渐升高,且各组之间比较差异有统计学意义.(4)组织病理学观察:从光镜下观察,随着梗阻时间的延长,肝脏组织结构逐渐发生改变.假手术对照组见肝细胞无变形和坏死,无炎J哇细胞浸润,肝窦及小胆管无扩张.7d组见肝细胞气球样变性,肝窦扩张,汇管区小胆管及纤维组织增生.    14d组见肝窦扩一张,肝小叶被纤维组织包绕21d组见肝窦明显扩张,肝小叶被纤维组织包绕明显,假小叶基本形成.    2.肝衰模型:(1>一般情况:缺血45,30min组的大鼠较几15min组大鼠肝衰症状显著,一般在术后30}60min内即苏醒,多数不能翻身爬起,在1一2h后即逐渐进入肝衰竭状态,l2h后即开始相继出现昏迷,表现为拒饮拒食,活动明显减少,精神萎靡、嗜睡,身体蜷缩,鼠毛竖立,对痛觉反应迟钝,尿色发黄,腹壁手术切口少量渗血大鼠基本上于24h内死亡二剖腹后见残余肝脏组织肝脏肿大,呈紫褐色,包膜紧张(2)生存率分析:各组生存率见图1,随着术中缺血时间的延长,大鼠生存率显著下降,30min组、24h死亡率80%,符合急性肝衰竭的发病特点,45min组全部大鼠于短期内迅速死亡(3)肝生化:结果见表2.随着术中肝叶缺血时间的延长,肝脏损伤逐渐加重,且各组之间比较差异有统计一学意义(P<0.05)}(4)组织病理学观察:随着缺血时间的延长,肝脏组织结构逐渐发生改变.0min组和15min组可见肝细胞胞质疏松变性、气球样变和脂肪变,并有少量细胞坏死伴炎性细胞浸润,30min组与45min组肝细胞坏死和炎性细胞浸润更为明显,镜下见肝小叶结构破坏,以小叶中央静脉为中心的肝细胞出现大片变性坏死,肝小叶边缘残留少量较完整的肝细胞,坏死区有较多炎性细胞浸润,肝窦扩张,呈网眼状,并可见淤血及出血.    讨论    我们设计了胆总管梗阻7,14,21d3个组,观察梗阻时间对肝脏损伤的程度,并模拟肝切除前梗阻性黄疽的病理生理状态.综合考虑大鼠肝脏损伤情况及死亡率,我们选择了梗阻14d作为下一步肝衰模型制作的必要条件对于恶性梗阻性黄疽术前是否解除梗阻、解除梗阻的时机、内外引流方式目前仍然存在争议6一下为避免出现外引流所致的体液大量丢失及感染等并发症,我们于肝切除时行内引流术,采用胆总管与十二指肠间放置硅胶桥管的方式,手术操作简单、效果可靠.实验切除了大鼠肝脏约占总体积的30%r,切除体积符合临床肝切除的原则.行肝切除术时一般需要对肝血流进行阻断,对阻断的时间目前尚无统一意见二实验根据肝血流阻断时间不同分为氏15,30,45min组,观察了不同阻断时间对肝损伤的影响.在梗阻性黄疽基础上制作大鼠肝衰模型的研究,一般通过药物攻击而非肝切除来诱导肝衰,其他通过肝切除制作肝衰模型的方法,多为单纯切除不同比例的肝脏,而本实验引入了梗阻性黄疽对肝切除的影响,并探索了最适梗阻时间同时在行肝切除前实施了部分肝血流阻断,与全肝血流阻断比较,能有效防止胃肠道淤血,避免其对大鼠的损伤,较大程度延长了大鼠对血流阻断的耐受时间,有利于探索最适于肝衰模型制作的阻断时间.目前尚无动物模型能完全复制梗阻性黄疽患者行肝切除致术后肝衰这一病理生理过程,本实验亦是如此,但本实验通过制作梗阻性黄疽大鼠,类似临床的肝切除、肝血流阻断及胆汁内引流,更大程度模拟了这类患者的临床病理生理及手术治疗过程.    根据研究中对各组生存率的观察,我们发现大鼠在手术结束6一8h后开始大批死亡,考虑此时大鼠血清各生化指标已有明显改变,因此统一术后6h为采血时间.根据既往研究提示急性肝衰竭大鼠死亡一般发生于72h内i8-9},因此本实验选择观察大鼠96h生存率.结果显示:15min组死亡率低,肝脏损伤较轻,30min组转氨酶明显升高,肝细胞大片坏死,24h死亡率达80%,符合肝衰竭诊断而45min组大鼠因肝脏损伤过重,于短期内全部死亡,可供干预时间窗太短经过比较后,我们认为阻断30min组大鼠死于肝衰竭,且具有可逆性、可重复性,并有一定的治疗时间窗,其处理方法是较为合理的肝衰模型建立方法.    参考文献    Lau SH,Lau WY. Current therapy of hilar cholangiocarcinoma[J].Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International,2012.12-17.    Clary B,Jarnigan W,Pitt H. Hilar cholangiocarcinoma[J].Journal of Gastrointestinal Surgery,2004.298-302.    黄志强. 肝门部胆管癌外科治疗面临的问题与出路[J].中华实验外科杂志,2004,(7):773-775.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2004.07.001.    Suda K,Ohtsuka M,Ambiru S. Risk factors of liver dysfunction after extended hepatic resection in biliary tract malignancies[J].American Journal of Surgery,2009.752-758.    Arai T,Naqino M,Nimura Y. Hepatic failure following resection of cholestatic liver[J].Nihon Geka Gakkai Zasshi,2004.664-668.    Van der Gaag NA,Kloek JJ,de Castro SM. Preoperative biliary drainage in patients with obstructive jaundice:history and current status[J].Journal of Gastrointestinal Surgery,2009.814-820.    Kondo S,Hirano S,Ambo Y. Forty consecutive resections of hilar cholangiocarcinoma with no postoperative mortality and no passtive ductal mavgins:results of prospective study[J].Annals of Surgery,2004.95-101.    彭耀荣,李文滨,褚忠华. 大鼠同种骨髓间充质细胞门静脉输注对肝大部切除肝衰模型术后肝功能、生存率的影响[J].中华实验外科杂志,2011,(11):1887-1889.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.11.024.    黄华,陈钟,吴振宇. 微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭[J].中华实验外科杂志,2005,(12):1469-1471.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.12.018.    Terblanche J,Hickman R. Animal models of fulminant hepatic failure[J].Digestive Diseases and Sciences,1991.770-774.