p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂对急性出血坏死性胰腺炎肾损伤的保护作用

重症急性胰腺炎(SAP)是临床常见急腹症,常并　发多器官功能障碍综合征(MODS);其胰外器官损伤中肾功能障碍发生率仅次于肺功能障碍,为14%-43%,且大多同时伴有其他器官系统的损害;发展至急性肾功能衰竭(ARF)后病死率高达80%,出现ARF后其他脏器衰竭发生率也明显上升川;S,AP引起ARF的机制尚未完全阐明.目前认为细胞因子和炎性介质的持续过量释放是炎性反应综合征(SIRS)的本质,是导致急性出血坏死性胰腺炎(ANP)持续发展和形成MODS的重要原因.本实验旨在制作大鼠ANP肾脏损伤模型,观察模型中的肾脏损伤改变和细胞因子肿瘤坏死因子一.(TNF-a)变化规律,以及肾脏组织中p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表达规律,并观察应用p38MAPK抑制剂对ANP肾脏损伤细胞因子释放的影响.　　材料与方法　　1.实验动物及其模型制备:雄性SD大鼠90只,体质量250}300g,购自西安交通大学动物中心实验前禁食12h,自由饮水.腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.1m1/100g)麻醉.近十二指肠乳头开口处用无创血管夹夹闭胆胰管,逆行穿刺胆胰管,缓慢推注5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g).随机分为SAP组和SB治疗组(SB203580,p38MAPK抑制剂,SigmaChemical公司).假手术组(Sham组)30只胆胰管注射生理盐水0.1m1/100g.各组造模后于大鼠背部多点注射生理盐水2m1/100g;SB治疗组腹腔内注射SB203580}〕于术后1,3,6,12h剖杀大鼠.　　2.大鼠血清淀粉酶测定:各时相点剖杀大鼠后,下腔静脉采血2一3ml,沿试管壁缓慢注人加人抗凝剂的试管中,送生化室检测血清淀粉酶.　　3.酶联免疫吸附试验(E1.ISA)法测血清和肾脏组织的TNF-a水平:下腔静脉采血2一3ml,沿试管壁缓慢注人加入抗凝剂的试管中,立即置于200C,3000r/min离心10min,取上清,立即置于一80℃的冰箱中待测.收集肾脏组织,研磨组织,收集研磨液,离心,收集上清液,一80℃的冰箱中待测.ELISA检测.　　4.大鼠血清尿素氮(BUN)、肌配(Cr)采用全自动生化仪进行测定.　　5.[32一微球蛋白((32-MG)检测:血、尿(32-MG采川放射免疫法测定,所用仪器为西安二六二厂生产的丫免疫计数器(型号FJ-2008PS),药盒由北京北方生物技术研究所提供.　　6.大鼠肾脏组织p38MAPK的表达及其肾脏组织的白细胞介素(IL)-6及TNF-.检测:收集肾脏组织,免疫组织化学链菌素抗生物素蛋自一过氧化物酶(SP)法检测肾脏组织p38MAPK的表达.　　7组织学观察:各组大鼠于12h后处死,解剖胰、肝、肾、肺和心,观察其大体形态并行光镜观察,对肾组织作光镜及其电镜下观察.　　8统计学方法:应用SPSS11.0统计软件分析,结果均以均数士标准差(无士、)表示,两组间比较采用独立样本t检验及犷检验;组间讨一量资料采用配对样本t检验;多组间比较采用方差分析;相关关系采用直线相关分析(Pearson相关).　　结果　　1.大鼠血清淀粉酶的变化:Sham,SAP及SB组中,淀粉酶水平分别为(793.80士265.08),(4865.12士890.35),(2918.24士614.58)IU儿;腹水量分别为0,(3.76士1.12),(2.83土1.08)g;组间差异有统计学意义(P<0.05).　　2.TNF-.的变化:在3h和6h,ANP组及SB组中血液和肾组织中的TNF-a显著高于Sham组(P<0.01),但SB治疗组较ANP组下降(P<0.05,表1).　　3.大鼠血清BUN,Cr,(32-MG的变化:假手术组肺组织BUN,Cr,(32-MG低量表达,各时相点差异无统计学意义(P>0.05);SAP及SB治疗组各时相点的表达升高,到12h达高峰,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05);但SB治疗组与SAP组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01,表2).　　4.大鼠胰腺及其肾脏组织p38MAPK的表达:Sham组胰腺组织及其肾脏组织p38MAPK轻微表达.在ANP组中p38MAPK强阳性表达,且在第6小时达高峰.在SB组p38M,APK适度表达,与ANP组及Sham组差异有统计学意义(P<0.01)5.大鼠胰腺及其肾组织的光镜及其电镜观察:　　(1)Sham组大部分大鼠的肾小管、’肾小球的形态结构正常,少数可见肾小管上皮细胞形态模糊,肾小球轻度充血和肾间质轻度水肿ANP的大鼠腹腔内血性积液较多,胰周脂肪组织和腹膜上可见大量的皂化斑,胰腺呈大片出血坏死,肾脏未见明显出血,随着时间的延长,损害加重.到12h,'肾脏肿胀,被膜紧张,上有散在出血点,严重的肾盂可见轻度血尿.ANI'+SB组的大鼠腹腔也可见积液、皂化斑,胰腺水肿伴局灶性出血坏死,肺脏及其肾脏无明显器质性改变.(2)光镜可见ANP组的胰腺有大片出血坏死,可见炎性细胞浸润.　　3h肾小球轻度肿胀,’肾小管上皮细胞形态模糊;;6h肾小管管腔缩窄或闭锁,蛋白管型明显,_卜皮细胞散在坏死灶,间质水肿,炎性细胞浸润;‘肾小球肿胀、血管淤血加重;12h肾小球可见絮状嗜伊红染色的细胞,‘肾小管见大量红细胞管型,上皮细胞萎缩,少数大鼠上皮细胞可见大片状坏死.SB组上述病理改变明显减轻:’肾小球结构破坏不明显,肾小管上皮变性管腔存在,12h肾小管内可见少量蛋白性水肿液.(3)电镜下ANP的肾脏近曲小管的大部分微绒毛脱落,细胞质线粒体肿胀,大部分峪消化及空泡化..ANP+SB组的肾细胞结构完整,细胞器保护较好,线粒体轻度肿胀,’肾小管微绒毛完整6.相关分析:‘肾组织p38MAPK的表达和血BUN,Cr,TNF-a,'肾脏组织中的'I'NF-.和肾脏组织病理学呈正相关(r二0.742,P<O.OI;r=0.781,P<O.Ol;r=0.775,P<0.O1).　　讨论　　目前认为细胞一J子和炎性介质的持续过量释放是SIRS的本质,是导致SAP持续发展和形成MODS的重要原因z}oTNF-.是SAP中的1个重要因子,它的许多损伤作用是通过其他因子而产生的,有起始因子的作用;TNF-.可促进肾小球内皮细胞和上皮细胞合成内皮素一1(ET-1),FT-1可导致肾血管强烈收缩,损害肾功能而发展至ARF;TNF-.对肾小球内皮细胞和系膜细胞有直接毒性作用,间接影响肾血流量和肾小球滤过率,促进中性粒细胞在肾小球内聚集和释放氧自由基等毒性物质,促进肾小球毛细血管内纤维蛋白原的沉积且有抑制纤溶作用,进而影响肾小球滤过率.　　本实验相关分析也证实『11VF-.与肾脏损害呈正相关.本实验结果证实ANP并发肾损害,早期就出现微球蛋白升高SAP时p38MAPK参与调控机体炎性反应,免疫、应激等有关的细胞因子、炎性递质的基因转录.其中p38MAPK信号通路与炎性反应调控机制密切相关二主要是MAPK激酶的磷酸化,并使p38MAPK磷酸化和活化,活化的p38MAPK可介导热休克蛋白(H}p27)的磷酸化,使之变为有活性的磷酸化的H}p27,从而介导前炎性因子TNF-a/IL-6的生物合成,但这个通路叮选择性的被SB203580阻止.SAP时TNF_.大量释放,在SAP由局部病变发展到全身病理损害过程中起主要作用,其水平与SAP的严重程度、死亡率和预后明显相关.本实验结果证实大鼠胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠后,血清中的TNF-.在SAP组模型制成后6h达到峰值,并且下降缓慢,在12h仍维持于较高水平,血Bun,Cr及其尿微量白蛋白,随着时间的延长也升高;同时我们观察到,SAP组大鼠光镜及其电镜下并发肾脏损伤的程度6h开始变得明显,以后逐渐加重,大鼠肾脏组织中p38MAPK的表达显著增加,而用其特异性抑制剂SB203580后,‘肾脏组织中p38MAPK的表达显著减少,而且血清中的TNF-.显著减低,其变化和p38MAPK的表达一致,相关性分析表明,肾组织p38MAPK的表达和血BUN,Cr,TNF-a,肾脏组织中的TNF-.和肾脏组织病理学呈正相关,从而表明p38MAPK在肾脏组织单核巨噬细胞的释放渗出及其炎性介质的释放起重要作用.　　参考文献　　Pelichovská M,Cvachovec K,Hoch J. Intensive care for patients with severe acute pancreatitis with a significant multiorgan dysfunction[J].Rozhledy v Chirurgii,2004.443-450.　　Makhija R,Kingsnorth AN. Cytokine stom in acute pancreatitis[J].Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery,2002.401-410.　　刘红山,潘承恩. p38MAPK抑制剂对急性胰腺炎肺损伤肺内细胞间黏附分子-1表达和肺微血管通透性的影响[J].中华实验外科杂志,2010.471-473.