树突状细胞杂交瘤苗诱导免疫效应细胞对PC3生长的抑制作用

探索以手术为主的综合治疗研究在改善胰腺癌患者生存率及生活质量中十分重要.胰腺癌综合治疗有放疗、化疗、中医药治疗及生物学治疗.树突状细胞(DC)在诱导高效而特异的抗肿瘤细胞免疫反应中起关键作用L3}.本研究旨在观察DC瘤苗诱导群体免疫效应细胞对胰腺癌PC3的生长抑制作用.　　材料和方法　　1.材料:胰腺癌细胞株PC3由中国医学科学院协和医院提供,外周血DC及群体免疫效应细胞(去DC的单核细胞)来源于自愿正常人及北京市红十字会血液中心.裸鼠BALB/C,体质量16}18g,鼠龄5一7周,雌雄各半,由北京大学医学院动物中心提供.淋巴细胞分离液(Pharmacies,人粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人白细胞介素(IL)}、人肿瘤坏死因子(TNF)一.IL-2,细胞毒性分析试剂盒(Promeges公司),胎牛血清(Hyclone公司),高糖DMEM培养基,1640培养基(Cibco公司),流式细胞标记抗体CD1lcMicroBeads(MiltenyiBiotecGmbH).　　2.DC与免疫效应细胞分离、培养:用PBS液稀释新鲜全血并缓慢加人到有淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(PBMC),以贴壁法获取树突状细胞和免疫效应细胞.以GM-CSF,IL-4,TNF-a,IL;-2扩增DC及免疫效应细胞、3.PC3培养:取PC3细胞复苏,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养.　　4.细胞融合和筛选:用500g/L的聚乙二醇(PEG)按2:1的比例使DC与PC3细胞融合,融合前以30Gy照放射胰腺癌细胞PC3.再用CDllcMicroBeads标记,MiniMACS磁式细胞分选器分选出PC3-DC.置于含重组小鼠GM-CSF(rmGM-CSF)和重组小鼠ILK(rmIL}.,500n彭L)以及20%胎牛血清的RPM11640完全培养基中扩增培养2一3周.　　5.融合细胞成瘤试验:实验分为3组,每组裸鼠为6只:PC3-DC组、PC3+DC组、PC3组.分别在裸鼠右腋皮下接种O.1m11x10}.一2x10'0/L的活PC3-DC,PC3十DC,PC3.每3d观察肿瘤的生长情况,共观察45d.　　6.体外实验:取对数生长期的PC3做为靶细胞(2x104个/孔),效应细胞分为3组,无DC刺激的}I组、有DC刺激的A2组、有DC瘤苗刺激的A3组各组均按2.5:1.0,5:1,10:1,20:1,40:1的效靶进行杀伤实验(具体方法见说明书).　　7.体内实验:取对数生长期的PC3接种于裸鼠前肩肿部皮下,接种量及裸鼠数为:治疗组、预防组和阴性对照组均为每只裸鼠4x10}/L,每组6只裸鼠免疫效应细胞接种方法:治疗组待6只裸鼠的移植瘤全部长出后于肿瘤处接种DC瘤苗诱导的免疫效应细胞,每只裸鼠4.8x10'`/L,预防组先接种DC疫苗诱导的免疫效应细胞每只裸鼠4.8x10"/L,2d后再于对侧肩肿部皮下接种肿瘤细胞,在接种免疫效应细胞时,对照组给等体积10%胎牛血清的1640培养基.　　观察:分别于接种各种细胞后的第1天观察裸鼠的反应,然后每3d观察1次,于移植瘤发生后的第45天处死所有裸鼠并称瘤体的重量.　　8.统计学方法:应用SPSS16.0统计软件分析,采用9检验.　　结果　　1.体外实验:各组各效靶的杀伤效率:A1组最大杀伤效率为3.9%,A2组最大杀伤效率为33.9%,A3组最大杀伤效率为76.6%.　　2.体内实验:预防组接种PC3后25d内6例中无1例发生移植瘤,第30天6例中有1例发生移植瘤,第45天6例中仍只有1例发生移植瘤,对照组和治疗组接种PC3后于第12天全部发生移植瘤,观察至45d,所有裸鼠存活.给予免疫效应细胞后的第45天处死所有裸鼠,取出瘤体,称瘤体重量,各组比较差异有统计学意义(P<0.05),对照组分别与预防组、治疗组比较差异有统计学意义(P<o.oy,预防组和对照组比较差异有统计学意义(p<0.05.对照组、治疗组无远处转移,治疗组有1例肉眼可见肿瘤浸润,预防组无肿瘤浸润,对照组肿瘤破溃4例,远处转移3例,并均有肿瘤浸润讨论当今,瘤苗研究最主要的工作是在体外培养扩增DC,利用抗原或抗原多肤冲击致敏,然后将致敏DC回输或免疫接种至荷瘤宿主体内进行免疫治疗肿瘤全细胞抗原负载DC是目前致敏DC的主要方法之一介,而坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC是常用的肿瘤全细胞抗原负载DC的方法,本实验以30Gy照射过的胰腺癌细胞PC3与DC融合产生DC瘤苗,并进行体内外抗肿瘤实验收到良好效果.　　体外实验结果显示,DC瘤苗所诱导的群体免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效率高于DC疫苗诱导群体免疫效应细胞及无DC诱导的群体免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效率.裸鼠实验可见治疗组与对照组比较,其差异有统计学意义,并且治疗组无肿瘤远处转移,6例中仅1例肿瘤浸润,而对照组肿瘤破溃4例,远处转移3例,并均有肿瘤浸润,可以确定DC瘤苗能更有效地诱导免疫效应细胞对肿瘤的抑制作用;在预防实验中发现预防组接种PC3后Zsa内6例中无1例发生移植瘤,第30天6例中有1例发生移植瘤,可以认为DC瘤苗在预防肿瘤的发生中有一定作用.本实验结果显示,DC瘤苗诱导免疫效应细胞对肿瘤的抑制效果比DC疫苗诱导免疫效应细胞对肿瘤的抑制效果好.　　参考文献　　Xu Q,Zhang TP,Zhao YP. Advances in early diagnosis and therapy of pancreatic cancer[J].Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International,2011.128-135.　　赵玉沛,徐徕,丛林. 胰腺癌新辅助治疗的现状与展望[J].中华普外科手术学杂志(电子版),2011,(1):1-6.doi:10.3877/cma.j.issn.1674-3946.2011.05.001.　　王煜,牛洪泉,董芳永. 树突状细胞疫苗免疫治疗策略[J].中华实验外科杂志,2005,(6):757.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.06.045.　　Koido S,Hara E,Homma S. Cancer immunotherapy by fusions of dendritic cells and tumorcells[J].Immunotherapy,2009.49-62.　　Palucka K,Ueno H,Fay J. Dendritic cells and immunity against cancer[J].Journal of Internal Medicine,2011.64-73.　　Adam C,Mysliwietz J,Mocikat R. Specific targeting of whole lymphoma cells to dendritic cells ex vivo provides a potent antitumor vaccine[J].Journal of Traditional Medicines,2007.16.　　湛海伦,高新,邱剑光. 树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养体外抗肾癌的效应[J].中华实验外科杂志,2005,(9):1144.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.09.056.　　张娟,张锦垫,卓少宏. 胰腺癌细胞PC3与树突状细胞杂交瘤苗的实验研究[J].世界华人消化杂志,2004.276-279.　　孙早喜,孙诚谊,王福生. 树突状细胞疫苗诱导免疫效应细胞对PC3生长的抑制作用[J].中华实验外科杂志,2006,(1):26-27.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.01.009.