雷公藤甲素诱导肝癌细胞株HepG2凋亡与胞内钙离子浓度的关系

雷公藤甲素(雷公藤内醋醇)是从雷公藤中提取到的主要活性物质,经药理和临床试验表明其具有免疫抑制、抗炎、抗肿瘤及抗生育等生物活性.雷公藤甲素不仅能抑制肝癌细胞生长并诱导发生凋亡,而且可以减轻某些患者的肝损伤川,具有一定的保肝作用.其可能通过抑制热休克蛋白}o}Hs}o},增强半恍氨酞天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)级联反应〔2伙抑制胞核内核因子(NF)-KBp65蛋白表达和增加Caspase-3活性〔3〕来诱导肝癌细胞凋亡,而不是通过Bax/B细胞淋巴瘤/白血病一2(bcl-2途径:a}.钙是维持机体细胞功能和信号传导的必需离子.细胞内钙稳态是细胞功能正常进行的前提,一E}钙稳态被打破,Ca2+则充当第二信使触发或者调控多种细胞内事件而使细胞执行一系列特定的功能.研究表明,高浓度长时间的游离钙水平升高会促使细胞凋亡[5J.本实验旨在观察雷公藤甲素诱导肝癌细胞凋亡及其胞内Caz+浓度的变化.　　材料与方法　　1.材料:人肝癌细胞株HepG2购自南京凯基科技生物发展有限公司KG020,雷公藤甲素购自福建省医学科学研究所,1640培养基、小牛血清购自Gibeo公司,曝哩蓝(MTT)、二甲基亚矾(DMSO)购自Sigma公司,膜联蛋白V一异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙锭(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司,Fluo-3,PluronicF-127购自美国Biotium公司.　　2.方法:(1)HepG2细胞培养:HepG2细胞株生长于含20%小牛血清及青、链霉素各100U/ml的1640培养液中,细胞置于370C,5%CO:培养箱中培养,每2d换1次液.取对数生长期细胞用于实验.(2)MTT比色法测定细胞生长抑制率:将浓度为】x10'/L的细胞悬液接种于%孔培养板中,待细胞完全贴壁后,实验组每孔分别加人雷公藤甲素溶液100闪(浓度12.5,25.0,50.0,100.0p,g/L),每个浓度设6个复孔,同时设不加药的对照组和只加培养液的调零孔.48,72h后分别取出培养板,每孔加人MTT溶液(5g/L)20闪,孵育4h后,弃去孔内培养液,每孔加人150闪DMSO,振荡10min后在酶联免疫检测仪检测490nm波长处的每孔吸光度(A)值.(3)流式细胞术检测细胞凋亡率:将浓度为1x108/L的细胞悬液接种于6孔板内,贴壁或过夜后加人雷公藤甲素(浓度12.5,25.0,50.0,100.0p,舒L),同时设不加药对照组,分别培养24,48,72h,收集1/106细胞,加人500p,1的结合缓冲液悬浮细胞再加人5闪AnnexinV-FITC混匀后,加人5},lPI,混匀,室温、避光、反应5一15min,用流式细胞仪进行荧光强度分析.(4)CaZ‘荧光探针Fluo-3染色,激光共聚焦显微镜检测细胞内Caz十荧光强度:将浓度为2x108/L的细胞悬液,接种于激光共聚焦显微镜专用玻底培养皿,贴壁后加人雷公藤甲素(浓度12.5,25.0,50.0,100.0群L),同时设不加药对照组,分别培养24,48,72h,用磷酸盐缓冲液(PBS)液漂洗3次后,加人100闪含有Fluo-3/AM(终质量浓度为5},i,mol/L)和PluronicF-127(终质量浓度为0.0625%)的负载液,避光、370C,5%COZ孵育45min后,吸去负载液,再用PBS漂洗3次,加人1ml无血清培养液,用激光共聚焦显微镜检测细胞内Caz十荧光强度.使用LeicaLASAFLite软件分析细胞荧光强度.　　3.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件分析,数据以均数士标准差(无士、)表示,以F检验检测数据方差齐性,采用单因素方差分析.　　结果　　1.雷公藤甲素抑制肝癌HepG2细胞的生长增殖:MTI'比色法结果显示,24,48,72h下不同浓度雷公藤甲素各组抑制率比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);不同时间点各浓度组抑制率比较,差异有统计学意义(P<0.01).由此得出,雷公藤甲素能明显抑制HepG2的生长增殖,总体上具有时效、量效关系,随着药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强;随着作用时间的增加,抑制作用逐渐增强(表1).　　2雷公藤甲素诱导肝癌HepG2细胞凋亡:流式细胞术结果显示,相同时间下不同浓度雷公藤甲素各组与对照组的细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(p<0.01);各浓度组间比较,差异有统计学意义(P<0.OS或0.01),随着雷公藤甲素浓度的增高,HepG2细胞凋亡率逐渐升高.相同药物浓度下作用不同时间后的细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.01),随着雷公藤甲素作用时间的延长,HepG2细胞的凋亡率逐渐升高(表2).　　3.雷公藤甲素升高肝癌细胞HepG2细胞内Cat的浓度:激光共聚焦显微镜检测雷公藤甲素作用后的HepG2细胞胞内Cat+荧光值结果显示,不同浓度雷公藤甲素作用后的24,48h,细胞内CaZ+荧光值与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),具有明显的剂量一时效关系,随着药物浓度的增加,荧光强度逐渐升高,随着作用时间的增加荧光强度升高逐渐明显.而作用时间至72h时,12.5p,彭L和25.0p,g/L与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);50.0p,剔L和100.0p,扩L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),但比较24h和48h相同浓度组的荧光强度均有不同程度的减弱.由此可见,雷公藤甲素作用72h后,HepG2细胞胞内Cat+浓度开始下降,甚至恢复至正常水平(表3).　　讨论　　1978年Kaise和Edelman首次提出了细胞凋亡与胞质内CaZ十浓度的增加有关,之后的大量实验结果进一步证明,在大多数细胞凋亡过程中,胞质内游离的Cat+浓度均有所增加.有研究表明,肿瘤的发生与细胞增殖与凋亡的失衡关系密切,肝癌的迅速生长是癌细胞增殖旺盛与凋亡减少的结果.但已有研究证实雷公藤甲素可升高细胞内Cat+浓度,诱导肿瘤细胞发生凋亡.在其他药物诱导肝癌细胞凋亡研究中同样也发现了胞质内Cat十浓度的升高.　　本实验采用AnnexinV/PI双染色法检测不同浓度雷公藤甲素对HepG2细胞凋亡率,结果显示雷公藤甲素有诱导HepG2细胞凋亡的作用,且随着作用时间的延长、药物浓度的增高,细胞凋亡率逐渐升高,具有时效及量效关系.采用Caz+荧光探针Fluo-3标记雷公藤甲素作用后的肝癌细胞株HepG2细胞内Cat十,通过激光共聚焦显微镜检测荧光强度.结果显示:在不同浓度的雷公藤甲素作用于HepG2的24一48h,细胞内Ca"十浓度具有明显的剂量一时效关系,随着药物浓度的增加,离子浓度逐渐升高,随着作用时间的增加浓度升高逐渐明显,差异有统计学意义.对比流式细胞术的结果发现,随着雷公藤甲素浓度的增加,在凋亡百分率增加的同时,CaZ+浓度亦升高,由此得出雷公藤甲素可能通过升高细胞内Cat十浓度诱导细胞凋亡.雷公藤甲素可能通过以下途径升高胞质内Cat+浓度并最终激活Caspase-3,导致HepG2凋亡:当雷公藤甲素诱导细胞凋亡时,Cat+可以通过内质网膜上的三磷酸肌醇(IP3)受体流出或从细胞外环境流人,从而导致细胞质内CaZ十浓度的升高.然后线粒体摄取Caz十,引起线粒体CaZ+超载,导致线粒体损伤,细胞色素C释放并激活Caspase-9,Caspase-9又激活了细胞凋亡的直接执行者Caspase-3,诱导了细胞凋亡.本实验结果表明,当作用时间至72h后,各实验组CaZ+荧光强度已出现下降,低浓度雷公藤甲素甚至降至正常值水平.CaZ+浓度从升高到下降的这种变化,可能是由于随着作用时间的延长,肝癌细胞通过内质网、线粒体的调节作用,使细胞Cat+达到平衡.大部分被释放到胞质中的CaZ+会由钙泵重新摄取回内质网中,以维持内质网内CaZ+浓度,而另一些Caz+则会被细胞膜上的Ca"十ATP酶和Na'-Ca2十泵清除.Ca-‘的释放和重新摄取形成内质网腔内和胞质游离Ca-十浓度的波动.　　参考文献　　赵永福,张水军,陈孝平. 雷公藤内脂醇对大鼠重症急性胰腺炎肝损伤的保护作用[J].中华实验外科杂志,2005,(6):689-691.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.06.018.　　尹亮,王亮,蒋维维. 雷公藤甲素对人肝癌细胞株HepG2体内外作用的研究[J].南京医科大学学报,2011.170-174.　　刘养岁,孔连宝,蒋维维. 雷公藤甲素对肝癌细胞株Hep G2顺铂化疗敏感性的影响[J].江苏医药,2010,(3):249-252.　　李瀚旻,罗春华,晏雪生. 雷公藤甲素对人肝癌Bel-7402细胞增殖及凋亡的影响[J].中华中医药学刊,2009.8-10.　　Apati A,Janossy J,Brozik A. Effects of intracellular calcium on cell survival and the MAPK pathway in a human hormone-dependent leukemia cell line(TF-1)[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2003.70-73.　　李传刚,杨春明. 榄香烯对人体膀胱移行细胞癌细胞系BIU _87细胞内游离钙的影响[J].中华实验外科杂志,1998.573.　　Garber K. Beyond the nobel price:cell cycle research offers new view on cancer[J].National Cancer Institute,2001.1766.　　Leuenroth SJ,Crews CM. Studies on calcium dependence reveal multiple modes of action for triptolide[J].Chemistry and Biology,2005.1259-1268.