双调控双功效溶瘤腺病毒对肝癌的抑制作用

观察表达Survivin基因小发卡RNA(shRNA)和内皮抑素基因(mE)的双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒在体内外实验中对肝癌的抗癌活性.方法以重组的双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒感染肝癌细胞,Westernblot鉴定肝癌细胞基因的蛋白表达,噻唑蓝(MTT)实验检测癌细胞增殖活性;建立肝癌裸鼠移植瘤模型,给予溶瘤腺病毒治疗,观察对移植瘤生长的抑制作用.　　3.溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE抗肝癌移植瘤疗效:裸鼠皮下接种5x106个细胞的SMMC-7721,2周后100%成瘤.分组用重组病毒瘤内多点注射,治疗病毒总量为1x1扩pfu.至治疗后35d,与对照组比较,CNHK500-shRNA-mE,CNHK500-shRNA,CNHK500-mE,Ad-mE对肝癌移植瘤生长的抑制作用差异有统计学意义,抑瘤率分别为77.41%(P<0.01),59.27%(P<0.O5),35.96%(P<0.O1)和25.94%(P<0.O5),以CNHK500-shRNA-mE抑瘤作用最强.同时携带shRNA和mE的双功效溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE比任一单功效腺病毒具有更强的肿瘤抑制作用.　　4.溶瘤腺病毒抗血管、诱导凋亡的病理学观察:肝癌移植瘤治疗后,CD34免疫组织化学标记间质血管、TUNEL法标记细胞凋亡.结果显示,溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE在肿瘤细胞内增殖并高效表达mE和shRNA,不但能够抑制间质肿瘤血管新生,而且大量诱导癌细胞凋亡(图5).对照组MVD为35.6士6.2,与之比较,CNHK500-shRNA-mE组MVD减少明显(11.5士3.8,P<0.07),其次是CNHK500-mE(23.7士10.4,P<0.O5)和Ad-mE组(29.8士8.4,P<0.O5).CNHK500一*hRNA-mE、CNHK500-shRNA,CNHK500-mE,Ad-mE组凋亡率分别为(26.3士7.5)%,(21.6士5.3)%,(9.s士3.6)%,(6.6士2.g)%,而对照组凋亡率为(5.2士1.5)%)与对照组凋亡率比较,CNHK500-shRNA-mE和CNHK500-shRNA组差异有统计一学意义(P<0.0l),CNHK500-mE组差异有统计学意义(P<0.05),而Ad-mE组差异无统计学意义(P>0.05).　　讨论　　1.肿瘤细胞Survivin的表达及其对细胞凋亡的影响:Survivin是一种凋亡抑制基因,是目前发现最强的凋亡抑制因子,与肿瘤的发生、发展、转移和预后密切相关.很多实验证实,Survivin在大多数肿瘤细胞中高表达,且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关.Survivin直接作用半眺氨酞天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase),主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性;Survivin也可通过p21间接抑制Caspase,阻止线粒体释放细胞色素C(CyclinC),抑制细胞凋亡.　　通过抑制癌细胞Survivin表达,能够诱导癌细胞凋亡,抑制癌细胞增殖,因此Survivin是肿瘤靶向治疗的一个很有前景的靶标.　　2.肿瘤间质血管对肿瘤的意义及其抗血管治疗策略:恶性肿瘤的快速生长和转移能力离不开丰富的血供,肿瘤间质血管新生的过程在肿瘤的发生发展中起重要作用.因此,抗血管生成治疗成为肿瘤治疗的辅助手段.1997年,科学家从小鼠血管内皮细胞瘤的培养上清中提取出的一种新的强效血管生成抑制因子,命名为内皮抑素,它由内生性胶原XVl}浚基端的183个氨基酸残基构成,内皮抑素可抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达,可直接作用于血管内皮细胞,特异J胜地抑制血管内皮细胞增殖和迁移,减少肿瘤血管的生成,从而抑制肿瘤的生长和转移.内皮抑素可用于肿瘤的治疗,其联合经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗原发性肝癌,能减少肿瘤血供、提高TALE的疗效,改善肝癌患者的整体生存时间和生活质量,是原发性肝癌治疗学重要的发展方向.　　3.本课题构建的双调控双功效溶瘤腺病毒对肝癌的治疗疗效:溶瘤腺病毒作为基因治疗的载体,已越来越受到重视〔8-9].我们前期构建了针对肿瘤细胞高表达端粒酶逆转录酶(hTERT)和缺氧诱导因子一1(HIF-1)的肿瘤特异性增殖型腺病毒CNHK500,该腺病毒由hTERT启动子调控腺病毒早期增殖基因Ela表达,HIF-1调控序列区缺氧反应元件(HRE)调控早期增殖基因Elb表达,使其在双启动子的调控下实现其对癌细胞的特异性杀伤和溶解作用,又称溶瘤腺病毒.　　以此双调控溶瘤腺病毒为载体,携带小鼠mE,抑制肿瘤间质血管生成,达到抑制肿瘤生长的目的.在裸鼠肝癌移植瘤模型中,我们观察到腺病毒的增殖和mE的表达,但肿瘤的抑制在停止治疗后呈恢复性生长,其主要原因是癌巢周边弥散性血供提供营养,使癌细胞增殖活性得到加强.　　我们将在前期研究的基础上,联合Survivin基因shRNA和mE的作用,构建了双调控双功效溶瘤腺病毒,既能抑制癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,又可以抑制肿瘤血管新生,达到进一步提高肝癌基因治疗疗效的目的.本实验结果证实,新构建的双调控双功效溶瘤腺病毒能够在肝癌细胞中增殖,并高效表达mE,同时能有效沉默Survivin表达,发挥抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡的作用.我们通过肝癌裸鼠移植瘤模型实验,证实同时携带shRNA和mE的双功效溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE比任一单功效腺病毒具有更强的肿瘤抑制作用.　　参考文献　　Xu C,Sun Y,Wang Y. CEA promoter-regulated oncolytic adenovirus-mediated Hsp70 expression in immune gene therapy for pancreatic cancer[J].Cancer Letters,2012.154-163.　　Diaconu I,Cerullo V,Hirvinen ML. Immune response is an important aspect of the antitumor effect produced by a CD40L-encoding oncolytic adenovirus[J].Cancer Research,2012.2327-2338.　　孙立臣,潘旭波,周先亭. 双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用[J].中华实验外科杂志,2012,(8):1529-1531.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.08.038.　　孙立臣,张柏和,张琪. 新型增殖型腺病毒CNHK500-hγ对肝癌细胞的杀伤作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2011,(6):635-640.doi:10.3872/j.issn.1007-385X.2011.06.009.　　Chen Z,Liu N,Zhu G. Targeting of the anti-apoptotic gene survivin in human thyroid carcinoma[J].International Journal of Molecular Medicine,2012.465-472.　　Chen XQ,Yang S,Li ZY. Effects and mechanism of downregulation of survivin expression by RNA interference on proliferation and apoptosis of lung cancer cells[J].Mol Med Report,2012.917-922.　　Cao H,Hu Y,Wang P. Down-regulation of Notch receptor signaling pathway induces caspase-dependent and caspase-independent apoptosis in lung squamous cell carcinoma cells[J].Acta Pathologica,Microbiologica Et Immunologica Scandinavica,2012.441-450.　　蒋冠,张凯,魏志平. 携带白细胞介素-24的增殖型腺病毒联合放疗诱导黑素瘤细胞凋亡的研究[J].中华实验外科杂志,2012,(3):547.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.03.071.　　张明,吴凤鹏,石金苓. 条件复制腺病毒Ad-MK联合丝裂霉素对膀胱癌细胞的作用[J].中华实验外科杂志,2012,(8):1633.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.08.083.