脂联素对门脉高压大鼠血流动力学的影响及其机制

脉高压症是肝纤维化的主要并发症之一,其特点是门脉系统明显的血流动力学改变,包括肝内循环阻力的增高及内脏循环血流量的增加.肝星状细胞(HSC)收缩引起肝血窦紧张而导致的肝内循环阻力升高是影响门脉高压重要的可逆性因素,也是药物研究的重要靶点[[2].脂联素(AD)是一种脂肪细胞因子,研究表明AD同时具有降低高血压等血管性疾病的危险性[3]及抑制星状细胞活性和抗肝纤维化的作用〔4〕.AD可通过激活腺昔酸活化蛋白激酶(AMPK)通路,引起细胞内一氧化氮(NO)合成酶活性的升高,进而产生N0}5}.肝脏NO水平对门脉血流动力学的变化有重要影响[6].我们应用AD静脉注射胆管结扎肝硬化(BDL)模型大鼠,观察AD对其门脉高压症血流动力学的影响;采用在体显微镜观察肝脏微循环变化,应用AD处理大鼠原代HSC,观察对HSC收缩的影响并探讨其药物作用机制.　　材料与方法　　1.材料:重组低分子质量鼠类AD(Biovendo:公司,捷克共和国);Histodenzgradient溶液、荧光素钠、内皮素一1(ET-1),L一硝基精氨酸甲酷(L-NAME,SigmaAldrich公司);蛋白酶E、胶原酶B,DNAseI(Roche公司);I型鼠尾胶原溶液(BDbioscience公司);血流动力学测量系统(ADInstruments公司,澳大利亚).　　2.实验动物及分组:相关操作及实验程序经当地动物伦理委员会审批通过,采用雄性野生型SD大鼠,购于澳洲实验资源中心.血流动力学实验,取大鼠30只,随机分为3组:假手术组、BDL模型注射AD组和BDL注射生理盐水组;在体显微镜观察实验取用大鼠及分组同前.　　3.BDL模型建立:面罩吸人式麻醉(2%异氟烷,氧流量0.4L/min).开腹暴露肝门.游离胆总管,双线结扎靠远端处切断.复位肠管,可吸收缝线缝合.　　假手术组仅行开关腹及暴露肝门操作.造模后4周进行血流动力学检测及在体显微镜观察,完成后处死大鼠,取肝组织做病理切片HE染色,了解病理变化.　　4.血流动力学指标检测:麻醉同前,电热毯保持大鼠体温.股动脉插管,进行平均动脉压(MAP)及心率(HR)测定;开腹游离门静脉,放置超声血流探头测量「J脉血流(PVBF).利用导丝于肠系膜分支血管置人导管,经肠系膜上静脉置管于与脾静脉交汇处,进行门脉压力(PVP)测定.待各项血流动力学指标稳定后,静脉注射AD(40},翻kg,溶于0.2ml生理盐水),对照组注射等量生理盐水.持续观察30minx.　　5.在体显微镜下观察肝脏微循环结果:氯胺酮(10m岁100g)及甲苯曝臻(0.1m岁100mg)肌肉注射麻醉.荧光素钠(1.5mg/kg)静脉注射,等候15min开腹后将大鼠移至显微镜载物台,将右侧肝脏自腹腔内取出,透明防水薄膜覆盖肝脏表面并同时将肝脏束缚至镜头上方的玻片表面.100x镜下观察肝脏边缘以减少组织结构过厚带来的血管重影.静脉注射AD(剂量同前),连续15min每隔5min进行拍照,在每张图片中随机选择5块同等大小的区域,避开大血管和疑似纤维化条索,图像软件分析肝窦直径及单位面积内肝窦开放数量.　　6.肝星状细胞胶收缩实验:配制胶原浓度为2郭L的I型鼠尾胶原溶液,每孔1.5ml加人6孔细胞培养板中,37℃孵育1h使胶成型.梯度密度离心法提取大鼠原代HSC}B},培养至第7天,胰酶消化,制成密度约为2.5x1J/L的细胞悬液.每孔2ml加人底层铺胶的培养板中.培养箱孵育过夜,更换无血清的培养基孵育4h,DMEM溶液冲洗3次〔9].胶收缩实验:以对照、AD(lm岁L)、ET-1(10nmol/L)、AD(1mg/L)+ET-1、AD(5mg/L)+ET-1,AD(1mg/L)+ET-1+L-NAME(5mmol/L)的顺序分别在6个6孔板各孔的培养基中加人药物.将胶从培养板上分离,成悬浮状态.连续6h每隔1h对胶的形状进行拍照,应用图像软件分析胶的表面积进行比较.　　7.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析.数据以均数士标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,组内用药处理前后数据比较采用重复测量方差分析.　　结果　　1.BDL大鼠门脉高压模型评价:BDL大鼠造模手术后约1周出现尿液颜色变黄,约10d出现皮肤黄染.血流动力学实验BDL大鼠死亡3只,存活率90.0%;在体显微镜实验BDL大鼠死亡4只,存活率87.8%n;各实验假手术大鼠无不良反应,存活率100.0%.病理学检查:BDL大鼠肝脏结构破坏明显,出现淤胆、胆管上皮细胞大量增生,炎性细胞浸润,为胆管炎表现;肝细胞被纤维条索分隔形成的假小叶,为肝硬化表现.假手术组为正常肝脏组织结构.门脉压力测量:BDL大鼠PVP对比假手术组明显升高(P<0.01).手术过程中可见BDL大鼠脾肾分流血管显著增生变粗;假手术组无此类改变.表明BDL大鼠肝硬化门脉高压模型建立成功.　　2.大鼠血流动力学测量(表1):股静脉注射AD后,BDL模型大鼠门脉压力及门脉血流量逐渐改变,15min后达到峰值,之后维持相对稳定状态.门脉压力下降9.7%(P<0.05),门脉血流量下降13.5%(P<0.05),同时注射AD对大鼠平均动脉压及心率无明显影响(P>0.05).对照组注射生理盐水后,30min内各项血流动力学指标无明显改变(P>0.05).　　3.在体显微镜观察大鼠肝脏微循环:BDL大鼠肝脏增厚变硬,背景荧光显著增强.肝窦直径对比假手术组明显缩窄(P<0.01),肝窦开放数量对比假手术组明显减少(P<0.01).经股静脉置管注射AD后,BDL大鼠微循环逐渐改变,5min后趋于稳定.肝窦直径增宽32.1%(P<0.01),肝窦开放数量有所增多但差异无统计学意义(P>0.05).BDL注射生理盐水组,15min内肝窦直径及肝窦开放数量无明显改变(P>0.05).　　4.肝星状细胞胶收缩实验:连续观察4h后,胶收缩趋于稳定.对照孔(A孔)呈现轻微收缩,为星状细胞附着的胶从培养板上分离后的正常现象;仅加人AD(B孔)对胶收缩无明显影响(P>0.05);仅加人ET-1(C孔)可使胶收缩明显增加(P<0.01);加人AD(1m留L)可以轻度阻滞ET-1的促星状细胞收缩作用(P>0.05);加人AD(5mg/L)可以明显阻滞ET-1的促星状细胞收缩作用,胶收缩面积约减少45%(P<0.O5);L-NAME可极大程度(93%)地拮抗AD的这种作用(P<0.O1).　　讨论　　BDL模型是一种常见的鼠类肝硬化模型,相对其他肝硬化模型有成模时间短、死亡率低、肝硬化产生后「〕脉压力高、脾肾分流静脉血管曲张迁曲明显等优点,适合进行血流动力学方面研究.但肝脏病理改变与人类常见肝硬化病理改变有较大区别,内环境紊乱是此类动物模型的缺点.　　当今针对门脉高压症的药物研究中,一个重要的标准就是对周围循环无影响或仅有微小影响.本实验应用AD治疗BDL肝硬化门脉高压模型大鼠,研究结果显示静脉注射AD可使BDL模型大鼠门脉压力及门脉血流量降低近10%,同时MAP及HR并无明显改变.可初步认为,AD的急性药理作用在减低门脉压力的同时,对周围循环无明显影响,具有成为降低门脉压力药物的潜力.有研究报道,静脉注射AD能够通过影响肾交感神经活动水平降低大鼠MAP及HR}'o7而在本实验中未发现类似变化.原因在于使用的动物模型不同:该研究采用的是未经造模的SD大鼠,而本实验采用的是BDL动物模型.BDL产生的肝硬化可以导致血清AD基础水平升高而体内AD受体减少〔川,同时肝硬化门脉高压大鼠处于低周围循环阻力高心输出量的高动力循环状态,其MAP相对正常大鼠处于较低水平,而HR则较正常偏快.因此,虽然本实验注射AD的剂量与该研究相近,但全身作用并未迭到影响并降低MAP和HR的程度.相关AD慢性用药的实验研究还发现,慢性AD处理(}N}g每日共8周)只对高血压模型大鼠具有降血压作用,而正常对照大鼠的MAP和HR无显著影响〔u肝硬化病变的肝脏内由于内皮细胞功能受损、氧化应激增高及炎性反应等原因导致舒张因子大幅减少,收缩因子增多使得Disse间隙周围激活的HSC通过收缩压迫纤维板内的再生肝小叶和分流静脉,引起可逆性肝内循环阻增加,从而导致门脉压力升高.在本实验中,在体显微镜观察发现AD能够明显增加BDL肝硬化模型大鼠的肝窦直径,而胶收缩实验发现AD抑制ET-1引起的胶收缩,说明AD有抑制HSC收缩的作用,这在一定程度上解释了其能够通过急性药物作用减低肝内循环阻力并降低门脉压力的机制而AD抑制胶收缩的作用又极大程度的被NO拮抗剂L-NAME所阻滞,从另一方面说明了AD是通过nJ激细胞产生NO来抑制星状细胞收缩的.　　参考文献　　Kaneda K,Sogawa M,Matsumara A. Endothelin-1 induced vasoconstriction causes a significant increase in portal pressure of rat liver:localized constrictive effect on the the distal segment of preterminal portal venules as revealed by light and electron microscopy and serial reconstruction[J].Hepatology,1998.735-747.　　徐钧. 肝星状细胞对肝脏微循环调节机制的研究进展[J].中华实验外科杂志,2003,(2):189-190.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2003.02.046.　　Zhu W,Cheng KK,Vanhoutte PM. Vascular effects of adiponectin:molecular mechanisms and potential therapeutic intervention[J].Clinical Science(London),2008.361-374.　　Shafiei MS,Shetty S,Scherer PE. Adiponectin regulation of stellate cell activation via PPARγ-dependent and-independent mechanisms[J].American Journal of Pathology,2011.2690-2699.　　Osuka K,Watanabe Y,Yasuda M. Adiponectin activates endothelial nitric oxide synthase through AMPK signaling after subarachnoid hemorrhage[J].Neuroscience Letters,2012.2-5.　　张海婴,吴志勇. 一氧化氮合酶与门脉高压高动力循环[J].中华实验外科杂志,1999,(3):284-285.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.1999.03.052.　　Schüder G,Vollmar B,Richter S. Epi-illumination fluorescent light microscopy for the in vivo study of rat hepatic microvascular response to cryothermia[J].Hepatology,1999.801-808.　　Elinav E,Ali M,Bruck R. Competitive inhibition of leptin signaling results in amelioration of liver fibrosis through modulation of stellate cell function[J].Hepatology,2009,(1):278-286.doi:10.1002/hep.22584.　　Sohail MA,Hashmi AZ,Hakim W. Adenosine induces loss of actin stress fibers and inhibits contraction in hepatic stellate cells via Rho inhibition[J].Hepatology,2009.185-194.　　Tanida M,Shen J,Horii Y. Effects of adiponectin on the renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats[J].Experimental Biology and Medicine(Maywood),2007.390-397.