表没食子儿茶素没食子酸酯、β-羟基-β甲基丁酸盐联合治疗癌症恶病质

恶病质是一个复杂的，多因素导致的，以骨骼肌质量(伴或不伴脂肪质量的减少)逐渐丧失为主要特征的综合征〔’l。70%的患者会出现严重的疲劳。本研究旨在观察表没食子儿茶素没食子酸醋(EGCG)和(基书甲基丁酸盐(HMB)对癌症恶病质小鼠的十预，探讨癌症恶病质发生的机制及药物联合应用的疗效是否优于单用，为临床药物治疗癌症恶病质提供依据。　　材料和方法　　1.材料:近交系BALB/C小鼠，雄性。鼠龄6一8周，体质量20一25g,SPF级，由上海斯莱克实验动物中心提供。小鼠结肠腺癌Colon26(C26)细胞株由北京肿瘤细胞研究所提供。　　2.动物分组:40只小鼠完全随机分为5组:A组空白对照;B组安慰剂治疗;C组EGCG治疗;D组HMB治疗;;E组联合治疗，每组8只。　　3.癌症恶病质模型的建立:分别取0.1ml含lx10'个细胞)C26结肠癌细胞悬液接种于B,C,D,E组小鼠的右前腋皮下，整个接种过程在1h内完成。从可以触及皮下肿瘤开始监测肿瘤体积。肿瘤体积的估计采用公式:V=0.5xab2(a,b分别为肿瘤的长度与宽度)。肿瘤重量采用公式:M=VxF(F为实验结束时肿瘤实际重量与体积的比值)。所有测量均在甸大同一时间进行。当荷瘤小鼠摄食量减少，出现颈背部毛发毛糙、活动迟缓等表现，并且体质量下降至与正常对照组差异有统讨一学意义时，即进人癌症恶病质期}sy。　　4.治疗方法:待接种肿瘤的小鼠均进人恶病质状态后开始治疗。B组小鼠给予生理盐水0.2ml灌胃;C组小鼠按照剂量进行灌胃EGCG组0.6mg/只;HMB组250mg/kg灌胃;;E组小鼠按照0.6mg/只剂量进行EGCG灌胃和250m舒kg灌胃剂量进行HMB灌胃以上治疗均为每天1次，连续治疗7d.　　5.小鼠血清指标的检测:检测总蛋自(}l'P)、血糖(Glu)、血清甘油只酷(TG)、血清白蛋白(ALB)用全自动生化分析仪测定(日本一化公司产品)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(1'NF)一。和C一反应性蛋白(CRP)试剂盒均购自北京鼎国公司，严格按照说明书操作。　　6.标本的收集:16d取眼球后静脉血，室温下静置2h后，经过3000r/min离心10min，取血清一20℃冰箱冻存备用。处死小鼠后测体质量、瘤体质量及右后肢胖肠肌重量。肿瘤组织经4%多聚甲醛固定，以备免疫组织化学使用。排肠肌先短暂置于液氮中，后移至一800C}冰箱中冻存备用.　　7免疫组织化学检测:免疫组织化学链霉卵白素-生物素一辣根过氧化物酶复合物(SP)法检测NF-KB活性，NF-KBp65蛋白阳性细胞呈棕黄色颗粒，主要位于细胞核，用Image-proPlus6.0医学图片分析软件分别分析图片中阳性细胞表达面积(Area)和阳性区域积分吸光度(IA)值。　　8.荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)分析:排肠肌中RNA提取采用Trizol试剂盒(美国工nvitrogen公司)，纯度的评估在紫外光260/280nm的比例下，完整度测定均在1%的琼脂糖凝胶上进行。RNA逆转录cDNA采用M-MLVIststand试剂盒(美国Invitrogen公司)。FQ-PCt'扩增:DNA采用TaqMan基因表达分析.　　技术(美国ABI7500公司)，使用预先设计和得到验证的引物和内参(中国，上海生工生物公司，表1)，标准化的内参照使用卜actin，结果使用值。　　9.统计学方法:计量数据以均数士标准差表示，组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，应用sPSS19.o统计软件分析。　　结果　　1.小鼠体质量、肿瘤生长、摄食量比较:接种后12d,B,C,D,E组小鼠体质量都低于A组(P<0.05)C,D,E组治疗组小鼠去瘤体质量有所上升(P<0.05)。从图1可见ECCG和HMB可以抑制肿瘤的生长(P<0.05)。各组间食物摄人量差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表2.　　2.小鼠右侧排肠肌重量比较:在治疗7d后，B,C,D,E组小鼠右侧排肠肌重量均低于A组(P<0.05)0C,D,E组小鼠右侧排肠肌重量均高于B组(P<0.OS)，而C,D组之间胖肠肌重量的差异无统计学意义(P>0.05),E组排肠肌质量比C,D组有所上升。结果见表2.　　3.小鼠营养指标的比较:与A组比较_9B组血清TP,ALB和Glu水平显著下降(P<0.05),TG水平上升(P<0.05)。在治疗7d后，B,C,D,E组ALB水平都有所上升(P<0.05)oC,D,E组G1u水平高于B组(P<0.05),D组升高最明显(P<0.05)}TG水平有所降低(P<0.05);C,D组ALB和TG水平的差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表3。　　4.小鼠血清细胞因子水平变化:B组血清IL-6,TNF-cx和CRP水平显著升高(P<0.05)。给予7d治疗后，C,D,E组小鼠血清IL-6,TNF-。和CRP水平比B组有所下降(P<0.05),E组小鼠IL-6,TNF-。和CRP水平低于C,D组(P<0.05)。结果见表35.NF-KB表达的比较:NF-KBp65蛋白免疫组织化学阳性产物呈棕黄色细颗粒，主要定位于肿瘤细胞细胞核中。NF-KBp65蛋白免疫组织化学染色显示积分吸光度(IA)值、NF-KBp65阳性细胞表达阳性面积(flrea)从表4可见，C,D,E组可以明显抑制NF-KBp65的表达，且B组p65核移位明显增多。其中以E组抑制效果最明显，而且与B组比较其差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表4.　　6.泛素蛋白酶体的E3连接酶相关蛋白肌萎缩F-box蛋白(MAFbx)基因和肌肉环状指蛋白基因1(MuRFl)的表达比较(图2):MAFbx和MuRFl基因:B,C,D,E组的表达水平与A组比较均升高;其中MAFbx基因:几D组较B组均下降(P<0.O5),E组较B组下降(P<0.0l);MURF-1基因:C,D组较B组均下降(P<0.05),E组较B组下降(P<0.01);两者在E组中的表达与C,D组比较均下降。　　讨论　　本研究采用目前已被证实的研究恶病质比较理想的接种小鼠结肠腺癌C26细胞的BABL/C小鼠来构建恶病质的模型颧4-51。本实验结果表明，癌症恶病质模型组小鼠去瘤体质量显著低于空白对照组，血清TP,ALB明显降低，TG水平升高，IL-6,TNF-a,CRP水平明显升高且差异有统计学意义，SP法测定NF-KB活性显著升高差异有统计学意义，FQ-PCR可见MAFbx,1VIuRF1基因表达水平也显著升高差异有统计学意义。　　EGCG是儿茶素中含量最高的成分。在癌症恶病质中，EGCG直接或间接抑制NF-KB,MAFbx,MURF-I导致的蛋白质的降解EGCG治疗组小鼠的体质量有所增加，右侧胖肠肌萎缩程度减轻，血清生化指标、IL-6,TNF-。和CRP水平较恶病质模型组得到明显改善，我们可以认为EGCG主要直接或间接抑制NF-KB的活性和抑制泛素蛋白连接酶}MAFbx和MURF-I活性，从而改善癌症恶病质。　　HMB是亮氨酸代谢的中间产物。最近有研究证实HMB能使骨骼肌的糖原含量和ATP增加，改善骨骼肌代谢，防止急性肌疲劳，亦能通过调控NF-KB的表达，发挥抗肿瘤，抗恶病质的作用;。本实验中HMB治疗组与安慰剂治疗组比较，小鼠的去瘤体质量有所增加，右侧胖肠肌萎缩程度减轻，血清生化指标水平都有所改善，iL-6,TNF-a和CRP水平明显低于安慰剂治疗组，NF-}cB移位水平也低于安慰剂治疗组，我们可以认为HMB可能通过抑制NF-KB的活性，改善骨骼肌的代谢，改善疲劳，从而改善癌症恶病质。　　本研究结果表明，两种药物联合应用的疗效明显好于单一用药，这可能EGCG主要抑制NF-KB的活J胜，减少MAFbx和MuRFl基因表达，治疗癌症恶病质。HMB可能主要通过抑制NF-KB的活性，改善骨骼朋的代谢，防止肌疲劳从而治疗癌症恶病质。两者联合应用时具有协同作用，从而有效地改善G26荷瘤小鼠的癌症恶病质症状。　　参考文献　　Fearon K,Strasser F,Anker SD. Definition and classification of cancer cachexia:an international consensus[J].Lancet Oncology,2011.489-495.　　Murphy KT,Lynch GS. Update on emerging drugs for cancer cachexia[J].Expert Opinion on Emerging Drugs,2009.619-632.　　周伟,江志传,姜军. 一种癌性恶病质动物模型的建立[J].中华实验外科杂志,2004,(4):490-491.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2004.04.039.　　陈思曾,肖建东,黄仲阳. C26腺癌恶病质动物模型的自然发展过程[J].中华实验外科杂志,2012,(7):1333-1336.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.07.046.　　1[5]陈思曾,郭永刚. 艾拉莫德、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐单用和联合治疗恶病质[J].中华实验外科杂志,2011.720-722.　　Ju J,Lu G,Lambert JD. Inhibition of carcinogenesis by tea constituents[J].Seminars in Cancer Biology,2007.395-402.　　Wang H,Lai YJ,Chan YL. Epigallocatechin-3-gallate effectively attenuates skeletal muscle atrophy caused by cancer cachexia[J].Cancer Letters,2011.40-49.　　Pinheiro CH,Gerlinger-Romero F,Guimaraes-Ferreira L. Metabolic and functional effects of beta-hydroxy-beta-methyl butyrate(HMB)supplementation in skeletal muscle[J].European Journal of Applied Physiology,2012.2531-2537.