B7-H1在结直肠癌血管内皮细胞与内皮细胞中的差异性表达及机制

共刺激分子B7-Hl是肿瘤免疫逃逸相关的重要分子之一，我们的前期研究显示B7-H1在结直肠癌组织及镶嵌血管内皮细胞中的异常表达很可能参与了肿瘤的免疫逃逸以及转移、迁徙等过程。正常血管内皮细胞并不组成性地表达B7-H1，是否B7-HI为结直肠血管内皮细胞(CCVEC)特异性表达及其表达的机制尚不清楚。本实验旨在观察体外血管内皮细胞(EC)与CGVECB7-H1的差异性表达，检测结直肠癌微环境中的相关因子巨如白细胞介素(IL)-10和干扰素(II'N)-y」对ECB7-H1表达的影响，探讨CCVECB7-H1差异性表达的机制。　　材料和方法　　1.材料:内皮细胞培养基(Sciencell公司)，兔抗人B7-H1单克隆抗体及链霉亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)即用型试剂盒(武汉博士德公司)，细胞因子II}lO,IFN-y(Ebiosicence公司)，Transwell小室(Corning公司),10%十二烷基硫酸钠(SDS),Tris-BASE(Sigma公司)，蛋白提取试剂盒(ProMab公司)，Trizol(Invitrogen公司)，SYBRGreenI染料(Gene公司)，ReverseTranscriptionSvstemA3500(Promega公司);IL-10和IF'N-y中和抗体(R&D公司)。人结直肠癌SW480细胞株、内皮细胞株及成纤维细胞株均为武汉大学人民医院中心实验室留存。　　2分组:(1)EC组:单独的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养;(2)CCVEC组:HUVEC与SW480细胞共培养所诱导的EC;(3)成纤维细胞组:与成纤维细胞共培养的HUVEC;(4)IL-10组:加人IL-10培养的HUVEC;(5)IFN-，组:加人IFN-y培养的HUVEC;(6)双因子联合(BFC)组:联合加人IL-lO,IFN-，培养的HUVEC;(7)IL-10中和组:加人IL-10中和抗体培养的CCVEC;(8)IFN-，中和组:加人IFN-y中和抗体培养的CCVEC;(9)BFC中和组:联合加人IL-I0,IFN-，中和抗体培养的CCVECJ3.细胞培养:HUVEC的分离与培养，CCVEC的诱导、培养参照文献。阳性干预药物加人浓度分别为40},扩LIL-10,50},g/LIFN-y，作用时间48h;阴性十预药物加人的浓度分别为IL-10中和抗体(10mg/L)和IFN-y中和抗体((7.5mg/L)，作用时间48h。　　4.细胞免疫组织化学:采用郭坤等经6」的方法，细胞膜和/或细胞质出现浅黄至棕褐色颗粒则判定B7-H1表达阳性B7-H1表达按阳性染色细胞百分率评分:0分为阴性，1分为1一25%,2分为26%-50%,3分为51%一75%,4分为>75%}Z}。　　5实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)检测:采用郭坤等的方法进行，B7-H1上游引物:5'-GC-CGACTACAAGCGAATTAC-3'，下游引物:5'-TCT-CAGTGTGCTGGTCACAT-3',扩一增产物594by}(3一肌动蛋白(p-acin)上游引物:5'-ATCGTGCGTGACATTA-AC>GAGAAG-3'，下游引物5'-AGGAAGGAAGCTG-GAAGAGTG-3'，扩增产物为211by。利用检测得到的Ct值和计算得到的扩一增效率，以p-actinmRNA的表达量为参照，计算B7-H1mRNA的相对表达量，计算公式二(1+Eac:aR-.}}}}no}}1+Er}}fn)ct}mriy。　　6.Westernblot检测:采用杨春康等的方法进行，Westernblot结果扫描传送至计算机，用Image-Pro-plus图像分析软件系统对蛋白条进行扫描并分析结果，以阶actin为参照，B7-Hl表达的相对含量以目的条带与内参条带灰度值的比值表示〔s;7.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析，各组细胞中B7-H1阳性表达率、B7H1mRNA及蛋白相对表达量用均数士标准差(x1s)表示，B7-H1中位染色评分组间比较采用秩和检验。　　结果　　1.B7-H1表达的免疫组织化学检测:EC呈阴性表达，CCVEC呈阳性表达，阳性细胞表达率为(75.00117.41)%，中位染色评分为3.13;成纤维细胞组中EC阴性表达。IL-10,IFN-y,BFC组均呈阳性表达，其阳性细胞表达率分别为(29.5814.86)%,(32.0815.08)%和(34.79土4.40)%，中位染色评分分别为1.46,1.58和1.71(P>0.05)，但小于CCVEC组(P<0.05)0IL-10中和组、IFN-y中和组、BFC中和组的阳性细胞表达率分别是(36.21士4.05)%,(31.04土3.56)%,(7.02士2.31)%，中位染色评分分别为1.89,1.61和0.62(P<0.OS)，且与CCVEC差异有统计学意义(P<0.O5)。　　2.Real-time_PCR检测B7-HlmRNA的表达:CCVEC组表达量为1.56士0.60oBFC,IL-10,TFN-y组表达量分别为1.32士0.47,1.01士0.26,1.03士0.22,BFC组高于IL-10组和IFN-y组的表达(P<0.05)，小于CCVEC组(P<0.05);1L-10中和组、IFN-y中和组、BFC中和组表达量分别为1.16士0.34,1.17士0.46,0.7210.22，与CCVEC组表达比较差异有统计学意义(P<0.05),BCF中和组表达小于IL-10与IFN-y中和组(P<0.05)，而IL-10中和组与iFN-y中和组表达无明显区别(P>0.05)}CCVEC,EC、成纤维细胞组间表达差异有统计学意义(P<0.05，表1)。　　3.Westernbolt检测B7-H1蛋白的表达:不同于EC及成纤维细胞组EC的阴性表达，CCVEC高表达B7-Hl蛋白(P<0.05)〕BCF组高于IL-10组与IFN-y组，并低于CCVEC组(P<0.05)。阴性干预组中，CCVEC组表达量最高(P<0.05),BCF中和组表达量最低(P<0.05)，而IL-10中和组与IFN-y中和组表达差异无统计学意义(P>0.O5，表2,图1)。　　讨论　　本实验与SW480细胞与共培养诱导的CCVEC的B7-HI表达阳性，而在相同条件下与成纤维细胞共培养的EC的B7-H1呈表达阴性，提示B7-HI表达局限于CCVEC中，且CCVEC的B7-HI的差异性表达与肿瘤微环境的诱导相关，因此CCVEC中B7-H1的差异性表达可能是由肿瘤细胞微环境内的某些细胞因子诱导所致。　　我们在本实验分别或联合加人IL-10与IFN-，细胞因子刺激HUVEC后，B7-H1均呈阳性表达，说明了IFN-y和/或IL-10的刺激也能够促进EC表达B7-HI分子为了进一步探明CCVEC的差异性表达是否由肿瘤微环境中的IL-10与IFN-y等细胞因子所致，本实验在CCVEC的培养基中分别或联合加人IL-10与IFN-y中和抗体作用后，再次检测CCVEC的B7-H1表达发现其表达明显下降。但同时可见无论是BFC组还是BFC中和组，其EC的B7-H1表达均与CCVEC和EC差异有统计学意义，提示尽管肿瘤微环境中的IL-10与IFN-，为CCVEC差异性表达的主要原因，但可能还存在其他的分子机制促进CCVEC中B7-Hl的差异性表达。　　本实验结果表明，与EC的B7-HI阴性表达不同，CCVEC高表达的B7-HI可作为区分EC与CCVEC的标志物之一二它可作为结直肠癌抗血管生成治疗新的潜在作用靶点。　　参考文献　　郑勇斌,龚文容,童仕伦. B7-H1在直肠癌与镶嵌血管中的表达及意义[J].中华实验外科杂志,2010,(3):356-357.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.03.031.　　何小波,郑勇斌,童仕伦. 共刺激分子B7-H1在直肠癌及癌旁组织中的表达及意义[J].临床外科杂志,2011,(3):180-183.doi:10.3969/j.issn.1005-6483.2011.03.016.　　郑勇斌,陈道达,谭海燕. 结直肠癌血管生成三维模型的体外构建[J].中华实验外科杂志,2006,(12):1499-1501.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.12.026.　　Marta R,Filippos P,Olivier G. Expression of PD-L1 and PD-L2 on human macrophages is up-regulated by HIV-1 and differentially modulated by IL-10[J].Journal of Leukocyte Biology,2011.507-515.　　Simone R,Flo(n)ani A,averino D. Stimulation of human CD4 + T lymphocytes via TLR3,TLR5 and TLR7/8 up-regulates expression of costimulatory and modulates proliferation[J].Open Microbiol J,2009.1-8.　　郭坤,马清涌,胡恒通. β受体在人胰腺癌细胞株中的表达及其在细胞侵袭中的作用[J].中华实验外科杂志,2009,(7):827-829.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2009.07.004.　　杨春康,王欣,应敏剐. 结直肠癌细胞株趋化因子受体的表达及其趋化实验[J].中华实验外科杂志,2010,(1):65-67.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.01.027.　　魏双,黄志勇,刘杨安. Ku80分子表达对肝癌细胞DNA双链损伤水平的影响[J].中华实验外科杂志,2011,(10):1646-1648.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.10.010.