原发性肝癌RASSF1A基因启动子区甲基化及其临床意义

　　肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是最常见的一种高度恶性的肿瘤，原癌基因的激活和抑癌基因的失活均可导致肿瘤的发生。Ras相关区域家族1A}}}(Rasassociationdomainfamily1A,RASSFlA)基因是近年来新发现的一个候选肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene,TSG，该基因的失活在多种人类肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。　　虽然基因缺失和点突变可引起基因的失活，但大量研究表明，该基因的失活与其启动子高甲基化有关。我们研究原发性肝癌中RASSFIA基因启动子的甲基化水平及其临床意义。　　材料与方法　　一、材料　　1一般材料:选取2010年!月至2011年9月福建医科大学附属漳州市医院手术切除原发性肝癌肿瘤标本及其癌旁组织100例，正常肝组织标本10例，所收集标本均经病理证实为原发性肝细胞癌。其中男63例，女37例，年龄(53.7士7.9)岁所选取的HCC患者术前均未行放、化疗或免疫治疗。标本存放于液氮中，再于一80℃冰箱保存肝癌细胞株(SNU398,QGY7701,BEL7402,Hep3B,HepG2,SMMC-7721)，购买于中国科学院f'.海生命科学研究院细胞资源中心。　　2.主要试剂与引物:UNTQ-10柱式动物基因组　　DNA提取试剂盒(卜海生工有限公司)，甲基化酶M.SssI(NewEnglandBioLabsInc·公司)，EZDN;Methylation-Gold-}}kit(Zymoresearch，USA)，ZymoTaqT}PreMix(Zymoresearch，US:4)，TrizolRNA抽提试剂(invitrogene公司)，逆转录试剂盒(fermenta、公司),PCR试剂盒}Fermerrtas公司)引物设计:均由卜海生土公司设计并合成RASSFIA基因甲基化特异性PCR引物:卜游引物(5'-GTGTTAACGGGTTGCCTATC-3')，下游引物(5'-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3')，产物大小:93by;非甲基化特异性PCR引物:上游引物(5'-TTTGGTTGGAGTGTGT1'AA'fGfG-3‘)，「游引物(5'-C:}AACCCCACAAACTAA;AAACAA-3')，产物大小:103byoRASSFIA基ICIR'f-PCRJI物:上游引物(5'-CTGTGCCCTCCAGCAAGAAG-3')，下游引物(5'-GGGTCATCC.ACCACCA_}1GAA-3'，产物大小:193by;内参基因阶actinRT-PCR引物:上游引物(5'-ACGTGGACA'fCCGCAAAGAC-3'，下游引物(5'-CAAAGGGTGTAACGCAACTA-3')，产物大小:308by。　　二、方法　　1.基因组DNA提取:按照DNA提取试剂盒操作方法从肝癌、癌旁、正常肝脏组织及肝癌细胞株中提取基因组DNA，通过紫外分光光度仪测定DNA浓度及A260/A280比值，经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　2.DNA亚硫酸氢钠修饰及甲基化特异性聚合　　酶链式反应(MSP):按照试剂盒EZDNAMethylation-GoldTMkit(Zymoresearch,USA)的操作步骤进行亚硫酸氢钠的转化:取500n};基因组DNA(组织及肝癌细胞株)，用DNA-freewater补足至20闪，加人130浏转换试剂，PCR仪卜反应:98℃放置10min,640G放置2.5h，然后通过层析柱完成DNA的纯化和脱硫甲基化特异性PCRI-(MSP)反应体系(12.5闪体系):PCRmix;7.5闪，上、下引物(10}.,mol/L)各:1闪,DNA模板:2},},去离子水补足至12.5闪。PCR反应条件:4℃预变性10min}40个循环(94℃30s,59℃30s,720G30、)>72℃延神10min。然后选用I1常人外周血淋巴细胞DNA作为甲基化阴性对照，该DNA经甲基化酶>vi.SssI处理作为阳性对照，空自对照选用去离子水lUISP产物经1.5%琼脂糖凝电泳鉴定:1)非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片段而甲基化特异性引物末扩增出相应长度的片段为甲基化阴性。(2)非甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片段而甲基化特异性引物打一增出相应长度的片段为甲婆化阳性3.甲基化抑制剂5-,4za-CdR处理肝癌细胞株:　　将RASSI'1A基因发生甲基化的细胞株(SNU39歇BIJL7402,Hep3B,HepG2)各分3组，通过细胞计数，每组含5\106数量的细胞，分别培养于含5-Aza-CdR终浓度为0,5,I0N.,mol/T的培养基中3d，用TrizolRNA步由提试剂操作方法提取RNA,用RT-PCR方法检测RASSFIA基因表达。　　统计学分析SPSS17.0统计软件进行数据分析，R:XSSFIA}}}1甲基化与临床病理特征的关系采用zX检测分析其相关性。　　结果　　一、基因组DNA检测　　肝癌组织所提取的基因组DNA经紫外分光光度仪测得纯度A260nm/A280nm大约为1.8一2.0之间，表明提取的DNA纯度高无RNA,蛋白质污染。取3闪基因组DNA检测DNA质量(图1)。　　二、RASSFIA基因启动子甲基化分析　　经甲基化j}}(M.SssI)处理后的人外周血淋巴细胞Dl}r1只扩增出甲基化产物(阳性对照)，而未经M.SssI处理的DNA只扩增出非甲基化产物(阴性对照)，证明实验中所设计的引物及操作方法可靠。用MSP法检测RASSFIA基因启动子甲基化，部分肝癌、癌旁及正常肝脏组织甲基化特异性PCR打一增结果见图2。实验组100例肝癌组织中有69例存在RASSFIA基因CpG岛的异常甲基化，对照组癌旁组织中有巧例，而正常肝脏组织中无RASSFIA基因甲基化发生，RASSFIA基因启动子异常甲基化在3种组织中的发生率差异有统计学意义(厂二67.75，P<0.001)。　　三、肝癌细胞株检测　　6株肝癌细胞株中有4株肝癌细胞株发生高甲基化(图3),RASSFIA基因启动子区发生甲基化的4株肝癌细胞株(SlyLT-398;BEL-7402;HEP-3B;HEPG2)经甲基化抑制剂5-aza-CdR处理后，RN电泳可见28S,18S两条带(图4)，其中28S和18S的亮度和宽度均约为2:1，表明所抽提的R-NA纯度高且没有降解。5-Aza-CdR处理肝癌细胞株后R}SSF'1A基因都重新恢复表达(图5)，说明启动子区甲基化与R;1SSF1_4基因的表达失活有关。　　四,1tASSFlA基因启动子甲基化与临床特征的关系肝癌组织中RASSFIA基因启动子甲基化状态与患者乙肝表面抗原及组织分化存在一定相关性(厂=11.341,P<0.05)，但与患者性别、年龄、肿瘤大小川宙床分期及肝硬化、门脉癌栓均无相关性(表1)}Pearson相关性分析发现，HBsAg与RASSFI:4基因启动子甲基化状态存在正相关(:=0.337,P=0.001)，组织分化与R.1SSF1A基因启动子甲基化状态存在n相关(r=0.297P=0.003)。　　讨论　　RassF1:}是近年来新发现的一个候选肿瘤抑制基因，该基因的失活在多种人类肿瘤的发生发展过程中起着重要作用二虽然基因缺失和点突变可引起基因的失活，但大量研究表明，该基因的失活与其启动子高甲基化有关。钱波等3」的研究发现，HCC中基因的启动子甲基化是一种普遍的事件。江小杰等发现，R,ASSF1A在肝癌组织中的表达下调，癌旁tL_常组织RASSF1AmRNA表达量为癌组织的3.32倍，基因甲基化可能是导致其基因表达降低的主要原因之一m。因此，我们有必要研究RASSFIA基因甲基化与其表达失活的关系，在DNA水平探讨RASSFIA在肝癌中可能的失活机制本实验运用甲基化特异性PCR(MSP)技术在DNA水平分析RASSFIA基因在原发性肝癌及肝癌细胞株的甲基化状态，并分析RASSFI;4基因甲华化与临床特征之间的关系。本研究发现100例肝癌组织中有69例(69%,69/l00)存在RASSFIA基因CpG岛的异常甲基化，癌旁组织中有15例(15%,15/100)发生甲基化，而正常肝组织中尤R;ASSF1A基因甲基化发生，RASSFIA基因启动子异常甲基化在这三种组织中的发生率差异有统计学意义，表明RASSFIA基因启动子区甲基化在肝癌中是普遍事件且RASSFIA基因频繁甲基化在肝癌的发生过程中可能起着关键作用。值得注意的是，69RASSFIA基因启动子区甲基化频率低十先前的报道，Saelee等{6研究29例肝细胞癌发现86%(25/29)的肝细胞癌存在RASSFIA甲基化，并与生存时间和预后显著相关这种差异可能与V1SP技术的敏感性、研究标本数以及不同CpG位点有关在其他类型肿瘤中RASSFIA基因也存在高甲基化，Malpeli等[0发现，80%(16/20)的胰腺癌组织存在RASSFIA甲基化，巨其基因表达沉默与甲基化状态呈正相关。人类皋丸肿瘤中，RASSFlA基因78.75%的GC位点发生甲基化，且与基因抑制明显相关，而正常塞丸组织则很少发生甲基化吕。　　体外肝癌细胞株的实验结果表明，4株发生甲基化的肝癌细胞株经甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理后，经RT-PCR证实，RASSFIA基因均重新恢复表达，此结果推测启动子区甲基化可能是RASSH'1}基因表达失活的主要因素，进一步证实了除了基因缺失和点突变，基因启动子区高甲基化也可引起基因的失活。有研究表明，通过去甲基作用可使多种含CpG岛的抑癌基因恢复表达并可逆转肿瘤细胞的恶性行为9。因此，Rz1SSF1,}基囚启动子甲基化的检测及甲基化抑制剂的应用有可能为肝癌提供新是一种诊疗方法。通过统计学方法分析临床资料发现:}L;}}}FI基因甲基化与患者乙肝表面抗原及组织分化存在一定相关性而乙肝表面抗原与肝硬化有关，组织分化又与肝癌的恶性程度密切相关，因此，R_}SSF1;4基因启动区甲基化程度可作为用于判断肝癌恶性程度的生物指标之一;在其他类型的肿瘤研究中也有相似的发现，肺癌中基因启动子区高甲基化与血管浸润、胸膜累及肿瘤组织低分化等临床病理囚索有关。　　总之，本研究发现R;4SSF1:}基因甲基化在肝细胞癌发生发展中起着重要作用，并与患者乙肝表而抗原及组织分化密切相关。但日前对R}SSF1a恭因在肝癌中作用机制的研究尚还处十初级阶段，还需更多研究者参与相关研究。　　参考文献　　Dammann R,Li C,Yoon JH. 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