核仁素在结节性甲状腺肿与甲状腺乳头状癌中表达及意义的研究

结节性甲状腺肿可发生癌变，其发生涉及胶质贮存、滤泡细胞增生、间质纤维化等;甲状腺乳头状癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤，常发生浸润、转移;二者疾病发生的分子机制至今尚不完全清楚。核仁素(又称C23)是真核细胞核仁中最主要的蛋自质，在大部分静止态细胞中仪表达于细胞核，而在增殖活跃和恶性肿瘤细胞中从胞核向胞质甚至胞膜迁移’。核仁素在甲状腺良恶性疾病中的表达与诊断治疗意义国内外鲜有研究。本研究检测核仁素在结节性甲状腺肿及甲状腺乳头状癌中的表达和分布，探讨核仁素在甲状腺良恶性疾病发生中表达的作用及临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料山东大学齐鲁医院2009-2011年行结节性甲状腺肿切除术的标本36例，男10例，女26例;年龄2173岁，中位年龄40岁。山东大学齐鲁医院2009年10月一2011年9月行甲状腺乳头状癌根治术的甲状腺乳头状癌标本60例，男12例，女48例;年龄1076岁，中位年龄42岁。癌转移情况:无淋巴结转移21例，有淋巴结转移39例。全部患者均手术并经病理证实，术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。

1.2主要试剂小鼠抗人核仁素单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗、多聚物辅助试剂与DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学染色(SP法)标本经甲醛液固定，石蜡包埋，厚连续切片;常规脱蜡、水化、H-Oz去除组织内过氧化物酶，组织抗原修复15 min;PBS冲洗5 min/次，共3次，加人山羊血清封闭20 min，力}l人小鼠抗人核仁素一抗4℃过夜;PBS冲洗5 min/次，共3次，加人多聚物辅助试剂孵育15 min;PBS冲洗5 min/次，共3次，加人辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗孵育20 min;DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片.在光学显微镜下观察染色情况、PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照

1.4结果判断以细胞核、细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达，以染色强度和阳性细胞百分比的评分作为标准。染色强度评分:无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞百分比评分:在低倍镜下(100x)随机选择10个视野，高倍镜下(400幻计数;每个视野记录100个癌细胞，并计算阳性细胞百分数，结果取10个视野的平均百分数，其中无阳性细胞为。分，阳性细胞<25%为1分，阳性细胞25%}50%为2分，阳性细胞>50%为3分。以染色强度与阳性细胞百分比评分的乘积表示核仁素的表达强度:0分为(一),1}3分为(+),4}6分为(++),7^-9分为(+++);其中，<4分为核仁素阴性表达，,4分者称为核仁素阳性表达。

1.5统计学处理应用SPSS 13.0统计软件分析，计数资料采用才检验，P,0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1核仁素在结节性甲状腺肿组织中的表达情况36例结节性甲状腺肿标本中，16例为核仁素阳性表达，其中卜+)11例，(+++)5例，阳性表达率为44.4%。核仁素表达于细胞核中，在细胞质与细胞膜上未见表达见图1

2.2核仁素在甲状腺乳头状癌组织中的表达情况60例甲状腺乳头状癌癌旁正常组织中核仁素均为阴性表达，而癌组织中均为阳性表达，其中(++)21例，(+++)39例;核仁素在甲状腺乳头状癌中表达的强度明显高于癌旁正常组织(P<0.01)甲状腺乳头状癌中，核仁素主要表达于细胞核，也可表达于细胞质和细胞膜。见图20 

2.3核仁素与结节性甲状腺肿和甲状腺乳头状癌表达与临床病理因素的关系1)核仁素的表达与结节性甲状腺肿患者的性别、年龄无关(P>0.05)。核仁素在在结节期的滤泡上皮阳性表达.阳性表达率为93.5%;胶质贮存期滤泡上皮以及结节期的纤维组织阴性表达，表达率分别为2.9%,3.1%，差异有统计学意义(P<0.01，表1)0 2)核仁素表达与甲状腺乳头状癌患者的性别、年龄无关(P>0.05;核仁素在淋巴结转移组与无淋巴结转移组的阳性表达率均为100%，但是核仁素在39例伴有淋巴结转移病例中，37例核仁素表达于细胞核和细胞质;在21例无淋巴结转移病例中全部仅表达于细胞核，差异有统计学意义(表2)

3讨论

核仁素是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，约占核仁蛋白质总量的10%正常情况下，核仁素主要存在于真核细胞核仁的致密纤维组分与颗粒区，具有调控核仁的发生、染色质复制、核糖体的合成以及抗细胞凋亡作用。近年研究表明，核仁素既可以在细胞膜表面作为多种分子(L一选择素、乳铁蛋白3等)或HIV的受体，亦可作为介导胞浆与胞核之间物质转运的穿梭蛋白s。核仁素的功能受到多方面的调控，如磷酸化、蛋白酶解、ADP2核糖基化、甲基化等，而且核仁素的高度磷酸化与:DNA转录的激活密切相关困。

36例结节性甲状腺肿中，核仁素在胶质贮存期滤泡上皮中阴性表达，在结节期的滤泡上皮阳性表达，且仅表达在于细胞核中。另外，60例甲状腺乳头状癌中，核仁素在癌旁正常组织呈阴性，而在癌组织中呈阳性表达。结果表明，核仁素可能参与两者的病理过程，并且表达受组织周围微环境的影响。结节性甲状腺肿中，胶质贮存期的巨大腺泡导致腺泡间结缔组织和血管减少，部分腺体可发生坏死、出血，进一步导致组织血供障碍而缺氧。同样，在甲状腺乳头状癌的实体肿瘤中，肿瘤细胞快速大量增殖，导致营养物质和氧气的供给不足，组织易发生缺氧。缺氧诱导因子一1(HIF-1)是缺氧反应的关键分子并上调多种因子的表达，如VFGF,COX-2认MMP9-。另外，癌组织大量分泌MMP9以降解基质，表达CCR7以促使癌细胞沿淋巴管趋化转移乳核仁素可以结合并松解组蛋自H1参与DNA复制，参与rDNA的转录与修饰、核糖体亚基的组装而参与mRNA的转录。基于以上分析，我们推测核仁素参与结节性甲状腺肿以及甲状腺乳头状癌病变组织多种因子的合成与分泌，亦是对缺氧环境的一科适应性反应。另有研究表明，核仁素与细胞增殖分裂速率正相关。核仁素在快速分裂的细胞以及肿瘤细胞中表达量相对高，原因可能与核仁素受cdc2激酶磷酸化调控有关。由此，核仁素可以用作判断乳头状癌细胞活跃程度的指标。本组结果还显示，结节性甲状腺肿中核仁素在滤泡上皮细胞中阳性表达，而纤维组织阴性表达核仁素在甲状腺乳头状癌未转移的组织中不出现核外表达，而在伴淋巴转移的组织中出现核外表达。有证据表明，核仁素表达水平的下调以及其分子结构的破坏均是细胞凋亡发生的重要因素，核仁素的下调可以直接导致细胞凋亡。

在结节性甲状腺肿中，纤维化组织中的核仁素阴性表达可能与纤维化过程中的滤泡细胞凋亡、坏死相关;核仁素除了在核仁中发挥作用外，还可在细胞表面作为多种配体的受体比如，人结肠癌细胞表面的核仁素是P一选择素的受体，而表达P一选择素的血管内皮细胞是促进癌血道转移的重要介质。用HB-19肤段封闭人乳腺癌细胞表面的核仁素，可特异性地抑制肿瘤细胞的生长。在甲状腺乳头状癌中，癌细胞表面的核仁素可能与淋巴管高静脉内皮表面的选择素相互作用，导致癌细胞沿淋巴管道向周围淋巴结转移。因此，核仁素有可能作为治疗甲状腺乳头状癌的靶点。同时，核仁素仅在伴转移的组织中出现核外表达，故可以通过表达分布的差异作为判断转移与非转移的有效、客观的指标，而避免了传统依靠染色强度统计评分的主观性总之，核仁素在甲状腺良恶性疾病中均表达，表达随疾病恶化而向核外转移。核仁素表达分布的差异性，可以作为判断甲状腺乳头状癌是否转移以及不良预后的重要指标，也为靶定治疗疾病提供理论依据。

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