远志皂苷元对AD模型小鼠学习记忆能力的影响及其机制研究

阿尔茨海默病(AD)是老年人常见的神经系统退行性疾病,以进行性记忆力下降、智力减退、行为异常或性格改变为主要临床特征[1]。目前,伴随着全球老龄化进程,AD作为一个影响民众健康的问题显得日益突出。最近国外有统计数据表明,80岁以上的老年人群中AD患病率已达30%,全球的AD患者数量为2600万左右[2]。当今社会AD不但严重影响了人们的生活质量,给患者的家庭也造成了极大的负担,目前已经成为困扰国际社会的一大难题。目前常用的AD治疗药物包括胆碱酯酶抑制剂、M受体激动药、防止β-淀粉蛋自(Aβ)沉积药和自由基清除药[3-4]等,但许多药物由于不良反应较大或者价格昂贵,应用受到限制。中国传统的中草药不良反应少,成为近年来改善学习记忆能力药物研究的热点。在中药类药物中,远志是一味常用的益智安神良药,而其中的单体远志皂苷元(Sen)在改善学习与记忆能力[5]、抗衰老[6]及抗氧化等[7]方面有显著作用。本实验采用双侧海马立体定向注射β-淀粉样多肽1-42片段(Aβ1-42)建立AD小鼠模型,观察远志皂苷元对AD模型小鼠学习记忆能力及ROS、8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)、3-硝基酪氨酸(3-NT)等氧化应激指标的影响,初步探讨远志皂苷元对AD的可能作用机制,为远志皂苷元的临床应用提供实验依据。

1 实验资料

1.1 动物 健康雄性SPF级B6小鼠,雌雄各半,体质量笏25~30g,2~3月龄,由南京大学动物实验中心提供。合格证书号SYXK(苏)2004-0013。饲养和实验过程中遵守实验动物管理与保护的有关准则。

1.2 试剂Aβ1-42(美国Sigma公司);远志皂苷元(上海抚生生物技术有限公司);ROS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);小鼠3-硝基酪氨酸检测试剂盒(上海杰美基因医药有限公司);8-羟基脱氧鸟苷酸检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)。

1.3 仪器 脑立体定位仪(上海奥尔博特生物仪器公司);微量注射器(上海高鸽工贸有限公司);Morris水迷宫视频分析系统(上海移数信息科技有限公司);LS55荧光分光光度计(美国Perkin Elmer);匀浆器(瑞士KINEMAT1CA);高速冷冻离心机(美国Sigma)。

1.4 方法 将60只小鼠随机分为模型组,Sen低、中、高剂量组和假手术组,每组12只。模型组,Sen低、中、高剂量组小鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(360mg/kg),固定于脑立体定位仪上,颅顶正中切开暴露颅骨,按Gcorg Paxins的小鼠脑立体定位图谱用脑立体定位仪及微量进样器进行小鼠双侧海马区立体定位注射(位置:前囟后2mm.中线旁开15mm,深度2mm),用1uL微型进样器注射针5min内缓慢注人Aβ1-421uL,留针5min,缓慢撤针,时间5min,防止注射的Aβ1-42通过针道溢出。注射完毕后清理创口,缝合皮肤,假手术组手术方法相同,注射同体积的生理盐水。术后给予青霉素钠盐4万IU肌注,每天1次,连续3d。术后第4天起,Sen低、中、高剂量组进行远志皂苷元灌胃,每天1次,其剂量分别是37,74,148mg/kg,假手术组和模型组灌胃等体积的生理盐水,连续用药3Od,灌胃结束后进行行为学测试。

1.4.1 学习记忆能力检测 采用Morris水迷宫检测学习记忆能力,30d灌胃结束后,进行Morris水迷宫行为检测,评价其学习记忆能力。实验条件:水池直径3000px,摄像镜头安放于水池中心正上方,平台直径150px,固定于第4象限,水池中水面高出平台平面25px,水温维持在乃℃左右。水迷宫由水池和自动录像、记录系统两部分组成。实验指标:①定位航行实验(学习能力)。连续进行5d,每天1次,分别从四个象限将小鼠头朝池壁人水,自动摄像系统和计算机分析处理系统记录每只小鼠的逃逸潜伏期,若60s后仍不能找到平台,以60s计算。前几天小鼠如找不到平台应引导小鼠至平台停留15s。②空间搜索实验(记忆能力)。第6天进行空间探索试验,将小鼠从I—Ⅱ—Ⅲ—Ⅳ象限的顺序从各人水点放入水池,记录ωs内小鼠在各象限游泳时间和穿越站台次数。

1.4.2 ROS含量测定 行为学实验结束后,迅速断髓处死小鼠,分离小鼠大脑海马组织,制成10%的组织匀浆,取上清液迅速冷冻保存。制备匀浆在4℃条件下进行,20min内完成。然后按照南京建成生物工程研究所提供的试剂及方法,利用Fenton反应的原理,使组织中的活性氧簇(ROS)与电子受体作用,用grees试剂显色,根据其呈色与活性氧含量成正比关系,测定组织中活性氧含量,即1mg组织蛋白在室温反应1mln,使反应体系中的H202浓度降低1mmol/L为1个活性氧单位(IU/mg)。每个样品同时检测6个平行样。

1.4.3 8-0HdG、3-NT含量测定 断头取脑,取海马组织置于EP管内,加人1mLpH7.4的PBS液充分匀浆;3000r/min离心20min,收集上清液。采用酶联免疫吸附实验双抗体夹心法测定8-0HdG和3-NT。在小鼠8-OHdG抗体和3-NT抗体包被的微孔板中,分别加人含8-0HdG或3-NT的标准品和样品,与辣根过氧化物酶标记的8-OHdG抗体和3-NT抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,彻底洗涤后甲基联苯胺(TMB)显色。用酶标仪在弱0nm波长下测量各孔吸光度值(A值)。结果以标准品浓度为横坐标、A值为纵坐标绘制标准曲线。根据样品A值由标准曲线查得相应浓度,再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。

1.5 统计学处理 计量数据用均数±标准误(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析(one-wayANo-VA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠在Morris水迷宫中逃避潜伏期情况比较见表1。

2.2 各组小鼠在Mollls水迷宫中空间探索情况比较见表2。

2.3 各组小鼠大脑海马组织Ros、8-oHdG、3-NT含量比见表3。

3 讨论

AD是老年痴呆中最常见的一种类型[8],临床主要表现为记忆力进行性减退,认知能力下降,并伴有人格和情感障碍等。自从Alzheimer于199Q年首次描述该病以来,AD的发病机制已经提出了基于各种实验的假说,主要包括anyl0id级联反应假说、胆碱能假说、能量代谢假说以及氧化应激假说[9]。大量最新研究表明[10],Aβ在脑内的沉积在AD发病中起了非常关键的作用。氧化应激学说认为Aβ的毒性作用与自由基有关。氧化应激参与了Aβ导致的神经毒性的调节,其机制可能是间接通过胞内活性氧簇的生成增多而引起的["]。ROS和自由基引起的氧化应激是导致DNA氧化性损伤的主要因素。据Ames等[12]研究发现,每个细胞代谢产生的自由基每天可使大约1万个DNA碱基被修饰,因此即便机体具备完善的氧化修复机制,也会有少量损伤的碱基得不到及时修复而引发损伤,如果氧化修复机制出现缺陷,则DNA的氧化损伤程度更加明显。目前发现的碱基氧化产物有30多种,其中鸟嘌呤氧化生成的8-oHdG是最重要的变异源性物质,被公认为评价DNA氧化的特异标志。蛋白质的所有氨基酸残基对羟自由基和活性氧的攻击均非常敏感,在受到各种氧化时可生成不同的氧化产物,如酪氨酸残基能生成3-NT和双酪氨酸等。Hensley等[13]将AD患者脑组织和脑脊液蛋白质降解发现其3-NT和双酪氨酸含量是年龄匹配对照组的5~8倍,提示蛋白质被过度氧化,因此3-NT可以作为蛋白质氧化的特殊标志物。张耀春等[⒕]发现远志提取物均能不同程度提高东莨菪碱、亚硝酸钠、电休克和自然衰老所致的学习记忆障碍模型小鼠的学习记忆功能。以小鼠逃避潜伏期和跨越平台次数以及目标象限游泳时间代表学习记忆能力,逃避潜伏期越短,跨越平台次数越多,目标象限游泳时间越长,表明小鼠学习记忆能力就越强。本研究中MorⅡs水迷宫实验结果证明远志皂苷元可以有效改善Aβ1-矽海马定向注射所致的AD模型小鼠的学习记忆能力,并且对其海马组织相关氧化应激指标(ROs、8-0HdG、3-NT)的检测结果表明经过3种不同剂量治疗的AD模型小鼠的氧化应激损伤明显下降,并且与治疗剂量呈正相关性,因此抗氧化作用可能为远志皂苷元治疗AD的主要作用机制之-。综上所述,相信将来通过中药提取技术的不断发展及进一步实验研究,远志皂苷元有可能成为治疗AD的安全、有效、廉价的理想药物。

4 参考文献

[1]Barnham KJ,Masters CL,Bush Al.Neurodegenerative disease andoxidative stress[J].Nat Rev Drug Discov,2004,3(3):205-214.

[2]Sastre M,Walter J,Gentleman SM.Interactions between APP secre-tases and inflammatory mediators[J].J Neuroinflammation,2008,18(5):25-37.

[3]方明锐.阿尔茨海默病治疗新进展[J].中外健康文摘,2009,6(11):89-91.

[4]Pasinetti GM.Cyclooxygenase as a target for the antiamyloidogenicactivities of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in Alzheimer's dis-ease[J].Neurosignals,2002,11(5):293-297.

[5]韦佳,陆大祥,戚仁斌,等.抗衰益智方Ⅰ对小鼠学习记忆能力以及海马胆碱乙酰转移酶表达的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(10):2051.

[6]闫明,李萍.远志抗衰老作用的研究[J].实用药物与临床,2006,9(1):22-23.

[7]Liang Z,Shi F,Wang Y,et al.Neuroprotective effects of tenuigeninin a SH-SY5Y cell model with 6-OHDA-induced injury[J].Neurosci Lett,2011,497(2):104-109.

[8]王晋慧.氧化应激与老年痴呆[J].老年医学与保健,2005,30(12):273-276.

[9]Christian B.Alzheimer’s disease and oxidative stress:implicationfor novel herapeutic approaches[J].Progress in Neurobiology,1999,57(3):301-323.

[10]Saravanakumar N,Bram K,Wilbert C,et al.AlphaB-crystallincompetes with Alzheimer’s disease b-amyloid peptide for peptide3/peptide interactions and induces oxidation of Abeta-Met35[J].FEBSL Letters,2006,580(25):5941-5946.

[11]Smith MA,Harris PL,Sayre LM,et al.Iron accumulation in Alzhei-mer disease is a source of redox-generated free radicals[J].ProcNatl Acad Sci USA,1997,94(18):9866-9868.

[12]Ames BN,Atamna H,Killilea DW.Mineral and vitamin deficienciescan accelerate the mitochondrial decay of aging[J].Mol AspectsMed,2005,26(4/5):363-378.

[13]Hensley K,Floyd RA.Reactive oxygen species and protein oxidationin aging:a look back,a look ahead[J].Arch Biochem Biophys,2002,397(2):377-383.

[14]张耀春,王立为.远志提取物对小鼠学习记忆的影响[J].中国新药杂志,2006,15(15):1254-1257.

阿尔茨海默病(AD)是老年人常见的神经系统退行性疾病,以进行性记忆力下降、智力减退、行为异常或性格改变为主要临床特征[1]。目前,伴随着全球老龄化进程,AD作为一个影响民众健康的问题显得日益突出。最近国外有统计数据表明,80岁以上的老年人群中AD患病率已达30%,全球的AD患者数量为2600万左右[2]。当今社会AD不但严重影响了人们的生活质量,给患者的家庭也造成了极大的负担,目前已经成为困扰国际社会的一大难题。目前常用的AD治疗药物包括胆碱酯酶抑制剂、M受体激动药、防止β-淀粉蛋自(Aβ)沉积药和自由基清除药[3-4]等,但许多药物由于不良反应较大或者价格昂贵,应用受到限制。中国传统的中草药不良反应少,成为近年来改善学习记忆能力药物研究的热点。在中药类药物中,远志是一味常用的益智安神良药,而其中的单体远志皂苷元(Sen)在改善学习与记忆能力[5]、抗衰老[6]及抗氧化等[7]方面有显著作用。本实验采用双侧海马立体定向注射β-淀粉样多肽1-42片段(Aβ1-42)建立AD小鼠模型,观察远志皂苷元对AD模型小鼠学习记忆能力及ROS、8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)、3-硝基酪氨酸(3-NT)等氧化应激指标的影响,初步探讨远志皂苷元对AD的可能作用机制,为远志皂苷元的临床应用提供实验依据。

1 实验资料

1.1 动物 健康雄性SPF级B6小鼠,雌雄各半,体质量笏25~30g,2~3月龄,由南京大学动物实验中心提供。合格证书号SYXK(苏)2004-0013。饲养和实验过程中遵守实验动物管理与保护的有关准则。

1.2 试剂Aβ1-42(美国Sigma公司);远志皂苷元(上海抚生生物技术有限公司);ROS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);小鼠3-硝基酪氨酸检测试剂盒(上海杰美基因医药有限公司);8-羟基脱氧鸟苷酸检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)。

1.3 仪器 脑立体定位仪(上海奥尔博特生物仪器公司);微量注射器(上海高鸽工贸有限公司);Morris水迷宫视频分析系统(上海移数信息科技有限公司);LS55荧光分光光度计(美国Perkin Elmer);匀浆器(瑞士KINEMAT1CA);高速冷冻离心机(美国Sigma)。

1.4 方法 将60只小鼠随机分为模型组,Sen低、中、高剂量组和假手术组,每组12只。模型组,Sen低、中、高剂量组小鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(360mg/kg),固定于脑立体定位仪上,颅顶正中切开暴露颅骨,按Gcorg Paxins的小鼠脑立体定位图谱用脑立体定位仪及微量进样器进行小鼠双侧海马区立体定位注射(位置:前囟后2mm.中线旁开15mm,深度2mm),用1uL微型进样器注射针5min内缓慢注人Aβ1-421uL,留针5min,缓慢撤针,时间5min,防止注射的Aβ1-42通过针道溢出。注射完毕后清理创口,缝合皮肤,假手术组手术方法相同,注射同体积的生理盐水。术后给予青霉素钠盐4万IU肌注,每天1次,连续3d。术后第4天起,Sen低、中、高剂量组进行远志皂苷元灌胃,每天1次,其剂量分别是37,74,148mg/kg,假手术组和模型组灌胃等体积的生理盐水,连续用药3Od,灌胃结束后进行行为学测试。

1.4.1 学习记忆能力检测 采用Morris水迷宫检测学习记忆能力,30d灌胃结束后,进行Morris水迷宫行为检测,评价其学习记忆能力。实验条件:水池直径3000px,摄像镜头安放于水池中心正上方,平台直径150px,固定于第4象限,水池中水面高出平台平面25px,水温维持在乃℃左右。水迷宫由水池和自动录像、记录系统两部分组成。实验指标:①定位航行实验(学习能力)。连续进行5d,每天1次,分别从四个象限将小鼠头朝池壁人水,自动摄像系统和计算机分析处理系统记录每只小鼠的逃逸潜伏期,若60s后仍不能找到平台,以60s计算。前几天小鼠如找不到平台应引导小鼠至平台停留15s。②空间搜索实验(记忆能力)。第6天进行空间探索试验,将小鼠从I—Ⅱ—Ⅲ—Ⅳ象限的顺序从各人水点放入水池,记录ωs内小鼠在各象限游泳时间和穿越站台次数。

1.4.2 ROS含量测定 行为学实验结束后,迅速断髓处死小鼠,分离小鼠大脑海马组织,制成10%的组织匀浆,取上清液迅速冷冻保存。制备匀浆在4℃条件下进行,20min内完成。然后按照南京建成生物工程研究所提供的试剂及方法,利用Fenton反应的原理,使组织中的活性氧簇(ROS)与电子受体作用,用grees试剂显色,根据其呈色与活性氧含量成正比关系,测定组织中活性氧含量,即1mg组织蛋白在室温反应1mln,使反应体系中的H202浓度降低1mmol/L为1个活性氧单位(IU/mg)。每个样品同时检测6个平行样。

1.4.3 8-0HdG、3-NT含量测定 断头取脑,取海马组织置于EP管内,加人1mLpH7.4的PBS液充分匀浆;3000r/min离心20min,收集上清液。采用酶联免疫吸附实验双抗体夹心法测定8-0HdG和3-NT。在小鼠8-OHdG抗体和3-NT抗体包被的微孔板中,分别加人含8-0HdG或3-NT的标准品和样品,与辣根过氧化物酶标记的8-OHdG抗体和3-NT抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,彻底洗涤后甲基联苯胺(TMB)显色。用酶标仪在弱0nm波长下测量各孔吸光度值(A值)。结果以标准品浓度为横坐标、A值为纵坐标绘制标准曲线。根据样品A值由标准曲线查得相应浓度,再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。

1.5 统计学处理 计量数据用均数±标准误(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析(one-wayANo-VA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠在Morris水迷宫中逃避潜伏期情况比较见表1。

2.2 各组小鼠在Mollls水迷宫中空间探索情况比较见表2。

2.3 各组小鼠大脑海马组织Ros、8-oHdG、3-NT含量比见表3。

3 讨论

AD是老年痴呆中最常见的一种类型[8],临床主要表现为记忆力进行性减退,认知能力下降,并伴有人格和情感障碍等。自从Alzheimer于199Q年首次描述该病以来,AD的发病机制已经提出了基于各种实验的假说,主要包括anyl0id级联反应假说、胆碱能假说、能量代谢假说以及氧化应激假说[9]。大量最新研究表明[10],Aβ在脑内的沉积在AD发病中起了非常关键的作用。氧化应激学说认为Aβ的毒性作用与自由基有关。氧化应激参与了Aβ导致的神经毒性的调节,其机制可能是间接通过胞内活性氧簇的生成增多而引起的["]。ROS和自由基引起的氧化应激是导致DNA氧化性损伤的主要因素。据Ames等[12]研究发现,每个细胞代谢产生的自由基每天可使大约1万个DNA碱基被修饰,因此即便机体具备完善的氧化修复机制,也会有少量损伤的碱基得不到及时修复而引发损伤,如果氧化修复机制出现缺陷,则DNA的氧化损伤程度更加明显。目前发现的碱基氧化产物有30多种,其中鸟嘌呤氧化生成的8-oHdG是最重要的变异源性物质,被公认为评价DNA氧化的特异标志。蛋白质的所有氨基酸残基对羟自由基和活性氧的攻击均非常敏感,在受到各种氧化时可生成不同的氧化产物,如酪氨酸残基能生成3-NT和双酪氨酸等。Hensley等[13]将AD患者脑组织和脑脊液蛋白质降解发现其3-NT和双酪氨酸含量是年龄匹配对照组的5~8倍,提示蛋白质被过度氧化,因此3-NT可以作为蛋白质氧化的特殊标志物。张耀春等[⒕]发现远志提取物均能不同程度提高东莨菪碱、亚硝酸钠、电休克和自然衰老所致的学习记忆障碍模型小鼠的学习记忆功能。以小鼠逃避潜伏期和跨越平台次数以及目标象限游泳时间代表学习记忆能力,逃避潜伏期越短,跨越平台次数越多,目标象限游泳时间越长,表明小鼠学习记忆能力就越强。本研究中MorⅡs水迷宫实验结果证明远志皂苷元可以有效改善Aβ1-矽海马定向注射所致的AD模型小鼠的学习记忆能力,并且对其海马组织相关氧化应激指标(ROs、8-0HdG、3-NT)的检测结果表明经过3种不同剂量治疗的AD模型小鼠的氧化应激损伤明显下降,并且与治疗剂量呈正相关性,因此抗氧化作用可能为远志皂苷元治疗AD的主要作用机制之-。综上所述,相信将来通过中药提取技术的不断发展及进一步实验研究,远志皂苷元有可能成为治疗AD的安全、有效、廉价的理想药物。

4 参考文献

[1]Barnham KJ,Masters CL,Bush Al.Neurodegenerative disease andoxidative stress[J].Nat Rev Drug Discov,2004,3(3):205-214.

[2]Sastre M,Walter J,Gentleman SM.Interactions between APP secre-tases and inflammatory mediators[J].J Neuroinflammation,2008,18(5):25-37.

[3]方明锐.阿尔茨海默病治疗新进展[J].中外健康文摘,2009,6(11):89-91.

[4]Pasinetti GM.Cyclooxygenase as a target for the antiamyloidogenicactivities of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in Alzheimer's dis-ease[J].Neurosignals,2002,11(5):293-297.

[5]韦佳,陆大祥,戚仁斌,等.抗衰益智方Ⅰ对小鼠学习记忆能力以及海马胆碱乙酰转移酶表达的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(10):2051.

[6]闫明,李萍.远志抗衰老作用的研究[J].实用药物与临床,2006,9(1):22-23.

[7]Liang Z,Shi F,Wang Y,et al.Neuroprotective effects of tenuigeninin a SH-SY5Y cell model with 6-OHDA-induced injury[J].Neurosci Lett,2011,497(2):104-109.

[8]王晋慧.氧化应激与老年痴呆[J].老年医学与保健,2005,30(12):273-276.

[9]Christian B.Alzheimer’s disease and oxidative stress:implicationfor novel herapeutic approaches[J].Progress in Neurobiology,1999,57(3):301-323.

[10]Saravanakumar N,Bram K,Wilbert C,et al.AlphaB-crystallincompetes with Alzheimer’s disease b-amyloid peptide for peptide3/peptide interactions and induces oxidation of Abeta-Met35[J].FEBSL Letters,2006,580(25):5941-5946.

[11]Smith MA,Harris PL,Sayre LM,et al.Iron accumulation in Alzhei-mer disease is a source of redox-generated free radicals[J].ProcNatl Acad Sci USA,1997,94(18):9866-9868.

[12]Ames BN,Atamna H,Killilea DW.Mineral and vitamin deficienciescan accelerate the mitochondrial decay of aging[J].Mol AspectsMed,2005,26(4/5):363-378.

[13]Hensley K,Floyd RA.Reactive oxygen species and protein oxidationin aging:a look back,a look ahead[J].Arch Biochem Biophys,2002,397(2):377-383.

[14]张耀春,王立为.远志提取物对小鼠学习记忆的影响[J].中国新药杂志,2006,15(15):1254-1257.