康宁”胶囊对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用

　　作者：黄晓菡1，曾文铤1，朱科伦1，卢鉴财2 作者单位：(1.广州医学院第一附属医院感染科;2.广州医学院第一附属医院检验科，广东 广州　510120)

　　【摘要】 目的：观察“康宁”胶囊(现已改名为丹芪活肝胶囊)对四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤的的保护作用。方法：取KM小鼠72只，随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组、丹芪活肝胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组6组，每组12只。小鼠分别灌胃给药，1次/d，连续5 d，末次给药24 h后，除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射0.05 g/kg的CCl4花生油溶液，24 h后采血，检测血清ALT、AST活性及观察肝组织病理学变化。结果：丹芪活肝胶囊能降低CCl4所致小鼠肝损伤中血清ALT或AST活性(P<0.01～0.05)。丹芪活肝胶囊高、中、低剂量组均能明显改善小鼠肝组织损伤的程度。结论：丹芪活肝胶囊对CCl4诱导的小鼠肝损伤有保护作用，其作用机制可能与保护肝细胞膜、减轻炎性反应有关，具体机制还需进一步实验研究。

　　【关键词】 肝损伤;四氯化碳;丹芪活肝胶囊

　　[ABSTRACT] Objective： To observe the protective effect of Danqi Huogan Capsule (DHC) on liver injury in mice induced by carbon tetrachloride (CCl4). Methods： 72 KM mice were randomly divided into six groups： normal control group， model group， bifendate group， high dosage group of DHC， medium dosage group of DHC， and low dosage group of DHC. All mice were administered with DHC by intragastric administration (ig)， one time per day for five consecutive days， and 24 hours following the last dosage of administration， the mice in groups except the normal control group were administered with CCl4 (0.05 g/kg) by ip. Blood samples were collected in 24 hours following the ip injection and the levels of ALT， AST activity content in serum were measured， and the pathological change of liver tissue were observed. Results： DHC has lowered the levels of ALT and AST activity significantly in the serum of the mice with liver damage induced by CCl4 (P<0.05， P<0.01). In addition， the pathological sections showed that the liver injury in both high and medium dosage DHC groups has been significantly improved. Conclusions： DHC can protect against liver injury induced by CCl4 in mice. The mechanism may be related to protection of liver cell membrane and reduction of the inflammatory response.

　　[KEY WORDS] Hepatotoxicity; CCl4， DHC

　　“康宁”胶囊(现已改名为丹芪活肝胶囊)为我院复方制剂，已经广泛应用于临床，主要成份有黄芩、菊花、丹参、山楂、黄芪等，主要药效是活血化瘀、清热解毒，在临床治疗慢性肝炎及肝纤维化方面取得了较好的疗效[1,2]。组方中各种单味中药具有抗肝炎药理活性，但复方制剂治疗肝损伤的基础研究却少有研究。本实验旨在通过建立四氯化碳(CCl4) 急性肝损伤模型对丹芪活肝胶囊的药效学及治疗机制进行研究，推动其在临床上的广泛应用。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　实验动物

　　取KM小鼠(SPF级)72只，体重17～20 g，雌、雄各半，由广东省医学实验动物中心提供。

　　1.1.2　主要药物和试剂

　　联苯双酯滴丸(广州星群药业股份有限公司)、四氯化碳(CCl4)(广东光华化学有限公司)、丹芪活肝胶囊(广州医学院第一附属医院，生产批号20081204)。联苯双酯加蒸馏水配成浓度为7.5 mg/mL联苯双酯溶液;丹芪活肝胶囊去壳取药，加蒸馏水配成浓度分别为66、33、16.5 mg/mL的丹芪活肝胶囊高、中、低剂量溶液。CCl4与花生油混合成0.5%的CCl4花生油溶液。丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂和天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂购自BECKMAN COULTER。

　　1.1.3　仪器

　　自动生化分析仪(BECKMAN SYNCHRON LX20)、离心机(eppendorf centrifuge 5415D)。

　　1.2　动物分组及处理

　　将72只KM小鼠随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组(0.15 g/kg)及丹芪活肝胶囊高剂量组(1.32 g/kg)、中剂量组(0.66 g/kg)、低剂量组(0.33 g/kg)共6组，每组12只，雌、雄各半。采用灌胃给药，各组均给药5 d,1次/d，正常对照组及模型组给予等量的饮用水作对照。各组小鼠给药第6天上午一次性腹腔注射CCl4 l0 mL/kg，夜晚禁食不禁水，24 h后摘眼球取血，离心分离血清，-20 ℃冰箱保存待测，用自动生化分析仪测定血清中ALT、AST的活性。取肝脏置10%甲醛溶液固定、石蜡包埋切片、HE染色，光镜下观察病理变化。

　　1.3　统计学处理

　　各组数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以(x-±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，如果方差不齐则用Tamhanle′s T检验。

　　2　结果

　　2.1　丹芪活肝胶囊对CCl4致小鼠急性肝损伤模型血清中ALT、AST的影响

　　模型组给予CCl4腹腔注射24 h后，血清中ALT、AST含量较正常对照组显著升高(P<0.01)。丹芪活肝胶囊高、中、低剂量组可以不同程度地降低肝损伤小鼠的ALT、AST含量，其中高剂量、低剂量组对ALT的降低与模型组比较有显著性差异(P<0.01);各剂量组对AST的降低均有显著性差异(P<0.05)。联苯双酯组与模型组比较，ALT有显著性差异(P<0.01)，但AST差异无显著性(表1)。表1　丹芪活肝胶囊对小鼠CCl4急性肝损伤模型血清　　ALT、AST的影响

　　2.2　丹芪活肝胶囊对CCl4致急性肝损伤模型小鼠的肝组织病理形态学的影响

　　正常对照组小鼠肝脏体积正常，呈鲜红色，表面光滑、边缘整齐，组织切片显示肝细胞形态结构完整，以中央静脉为中心呈放射状排列，排列规律，肝小叶结构清晰，肝索及肝窦清晰，肝细胞未见水肿及坏死;模型组在CCl4染毒24 h后成功诱导急性肝损伤，可见肝脏组织内大量炎性细胞浸润，肝细胞大片坏死，坏死区域累及肝小叶大部分或相连的几个肝小叶，小叶结构不清，残存的肝细胞轻度水肿，肝窦受压;丹芪活肝胶囊高剂量组小鼠肝细胞有小量炎性细胞，肝细胞形态结构完整，排列规则，结构清晰，未见水肿和坏死。中剂量组小鼠肝细胞有小量炎性细胞浸润，细胞轻度坏死，结构完整。低剂量组小鼠肝细胞有炎性细胞浸润，空泡变性，有轻度水肿，结构基本完整。与模型组比较，丹芪活肝胶囊不同程度地减少了CCl4诱导的肝损伤中肝细胞中的炎性细胞浸润、水肿、变性、坏死(图1)。注：(A)正常对照组，(B)模型组，(C)联苯双酯组，(D)丹芪活肝胶囊高剂量组，(E)丹芪活肝胶囊中剂量组，(F)丹芪活肝胶囊低剂量组。图1　各组小鼠肝组织病理学表现(HE×100)

　　3　讨论

　　CCl4诱导的急性肝损伤动物模型是最经典的实验性肝损伤模型，在形态学、病理生理学等方面和人肝损伤相似。CCl4进入肝细胞后，在内质网中由细胞色素P450产生活泼的三氯甲基自由基和氯自由基，与细胞内和细胞膜的大分子共价结合，使酶的功能丧失，细胞膜脂质过氧化，胞浆Ca2+浓度升高，导致肝细胞损伤和胞浆内转氨酶渗入血液，形态学上表现为肝小叶中央区坏死和脂肪变性，血清学指标为ALT、AST升高[3,4]。本实验模型组以腹腔注射CCl4造模后，小鼠血清中AST、ALT水平均比正常对照组明显升高;病理切片显示，模型组小鼠肝组织出现大面积水肿、空泡，大量炎症细胞浸润，并且有细胞变性、坏死，与其形态学和生化指标表现相符，造模成功。

　　丹芪活肝胶囊组方中，黄芪、丹参有抗病毒、抗炎的药理活性，黄芩、菊花能减少自由基引起的脂质过氧化反应，起到保肝作用[6-9]。Sun等[10]也证实黄芪降低CCl4诱导小鼠肝损伤中的血清转氨酶水平、减少脂质过氧化的发生。另有报道指出[11]，丹参能通过抗氧化和增加P450 2E1蛋白含量从而改善CCl4引起的肝毒性。

　　实验中，丹芪活肝胶囊能有效降低肝损伤小鼠血清的ALT或AST水平。肝脏活检是显示肝脏实质性损害、炎症活动、纤维化最好的指标。病理切片显示，与模型组比较，丹芪活肝胶囊给药组小鼠的肝细胞变性、坏死表现均普遍减轻，并且呈剂量依赖性，进一步证实丹芪活肝胶囊对肝细胞的保护作用。

　　丹芪活肝胶囊的药效可能通过多种途径完成：保护肝细胞膜的完整性、减轻炎症反应;抵抗脂质过氧化物对肝细胞膜的损伤;抗病毒、免疫调节;改善肝脏局部微循环等。

　　初步研究发现，丹芪活肝胶囊保护CCl4所致急性肝损伤，明显降低转氨酶，改善受损肝脏的组织学形态，其作用机制尚不完全清楚。今后将研究丹芪活肝胶囊在肝细胞损伤的脂质过氧化、血流动力学、免疫学等方面的保护机制，推动其更广泛的临床应用。

　　【参考文献】

　　1　朱科伦，马佩球，曾文铤，等.康宁胶囊减轻肝纤维化的临床研究[J].广州医学院学报，2001,29(1)：66-67.

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　　4　Berger ML， Bhatt H， Combes B， et al. CCl4-induced toxicity in isolated hepatocytes： The importance of direct solvent injury [J]. Hepatology， 1986(6)： 36-45.

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　　8　季旻游.丹参对肝脏的药理作用研究概况[J].中国药师，2005， 8(10)：877-878.

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　　10　Sun WY， Wei W， Li W， et al. Effects and mechanisms of extract from Paeonia lactiflora and Astragalus membranaceus on liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats [J]. J Ethnopharmacology， 2007， 112(2)： 514-523.

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