慢性乙型肝炎和肝细胞癌患者乙肝病毒BCP区1762/1764双突变的定量检测及其意义

　　作者：申悦平1， 徐君1， 满晓波2， 张园海1 作者单位：(1.镇江市第三人民医院感染科， 江苏 镇江 212021; 2.第二军医大学东方肝胆外科医院门诊部， 上海 210438)

　　【摘要】 目的： 观察乙型肝炎病毒基本核心启动子(basic core promoter ，BCP)区1762/1764双突变和肝细胞癌发病间的关系及意义。方法： 利用已构建的乙肝病毒BCP区A1762T/G1764A双突变复制质粒，设计特异性TaqMan MGB探针，采用特异性探针实时荧光定量PCR(PSRT-PCR)方法对从未进行过抗病毒治疗的80例慢性乙肝患者和50例已发生肝癌的慢性乙肝患者患者分别予以血清和肝组织双突变定量检测，比较双突变在这两类患者血清和肝组织中的发生情况。结果： 慢性乙型肝炎患者组血清突变率为41.25%(33/80)，肝组织突变率为45.00%(36/80);肝细胞癌组血清突变率为68.00%(34/50)，肝组织突变率为78.00%(39/50)，两组间的差异有统计学意义(P<0.005)。每组各自血清突变率和肝组织突变率无明显差异。乙肝组中高病毒载量患者(HBV DNA≥106/ml,43例)血清和肝组织的突变率分别为58.14%(25/43)、62.79%(27/43)，低病毒载量患者(HBV DNA<106/ml,37例)血清和肝组织突变率分别为21.62%(8/37)、24.32%(9/37)。高病毒载量患者血清及肝组织双突变率明显高于低病毒载量组(P均<0.01)。结论： 已发生肝癌的慢性乙肝患者BCP区双突变发生率明显高于未发生肝癌者，提示此双突变和肝癌的发生密切相关，检测此双突变有助于预测肝癌的发生;且血清检测和肝组织检测具有良好一致性。未发生肝癌的慢性乙肝患者病毒载量高提示双突变发生率高，及早进行抗病毒等治疗有助于降低双突变发生率。

　　【关键词】 肝炎病毒;基本核心启动子;基因突变;乙型肝炎;肝细胞癌

　　[Abstract]　Objective： To explore the feasibility of quantitative detection of double mutation in basic core promoter (BCP) 1762/1764 sites in hepatitis B virus (HBV) in chronic hepatitis B (CHB) and hepatocellular carcinoma (HCC) and the relationship between the mutation and HCC and its clinical significance. Methods： The mutant was accurately detected using probe-specific real-time quantitative polymerase chain reaction (PSRT-PCR) which adopted TaqMan MGB probe， the designing was depended on the double mutation plasmids which were constructed based on the wild recombinant replication competent plasmids of HBV. Their different effluence was compared between CHB and HCC. Results： After detecting the serum and hepatic tissue in 80 CHB patients and 50 HCC patients (all patients never accepted antiviral treatment)，the HCC group expressed a higher mutant rate (68.00% vs 41.25%， P<0.005) in the serum ，as well as in the hepatic tissue (78.00% vs 45.00%，P<0.005) respectively. The difference of mutation rate between the serum and the hepatic tissue was not significant either in CHB group and HCC group. In 80 CHB patients，compared with low viral load group (HBV DNA< 106 copies/ml,37 cases)，high viral load group (HBV DNA≥106 copies/ml,43 cases) expressed a higher mutant rate not only in the serum (58.14% vs 21.62%，P<0.005)，but also in the hepatic tissue (62.79% vs 24.32%，P<0.005). Conclusion： The higher rate of double mutation in patients with HCC hinted that the double mutation was related to the occurrence of HCC，which can be forecasted by detecting the double mutation. Based on the satisfactory consistency in detecting serum and hepatic tissue， to detect the patients′serums who could not accept drawing the tissue from their liver can accurately reflect their states of double mutation too， and it can easily be wide spreaded in clinic.High viral load hinted high mutation rate in hepatitis B patients without HCC，so furthermore early antiviral treatment can help to decrease the mutation rate.

　　[Key words]　hepatitis B virus;basic core promoter; mutation; hepatitis B; hepatocellular carcinoma

　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是我国常见的疾病[1]，HBV不仅可以引起急性肝炎和慢性肝炎，还会进一步发展成为肝硬化、原发性肝癌和终末期肝功能衰竭[2-4]。 鉴于中国的原发性肝癌和肝硬化主要是由乙型肝炎发展而来，就慢性肝炎和乙肝病毒携带者而言，其最终的危害在于肝硬化和肝癌的发生，所以预测乙肝患者发生肝硬化和肝癌是乙肝患者健康管理的重要内容。

　　变异是生物适应环境生存的重要方式，HBV有较高的变异性[5-7]，HBV最常见和最具有临床意义的突变包括核苷类药物耐药突变[8]、1896突变[9]和基本核心启动子(base core promoter， BCP)区1762(A-T)/1764(G-A)双突变[10-15]。

　　乙肝病毒BCP区变异和乙肝病毒的致病性密切相关[10]， BCP区1762/1764双突变，同重症肝炎、肝硬化和肝癌的发生密切相关[11-15]，在最终发生肝癌的乙肝患者中BCP区双突变的发生率明显升高;而一些追踪研究也发现，发生BCP区双突变的乙肝患者或者病毒携带者肝癌发病率有升高的趋势[16-17]。因此，可以认为BCP区1762/1764双突变与肝癌的发生密切相关。

　　在前期实验中，我们以1.5拷贝HBV野生重组质粒克隆了BCP区1762/1764双突变质粒[18]。本研究采用基于引物探针特异性的定量PCR方法准确检测了慢性乙肝患者与发生肝癌的乙肝患者BCP区双突变，对比两组患者的结果，探讨了此双突变和肝癌的关系及其意义。

　　1　材料和方法

　　1.1　病例来源

　　收集2005年1月至2009年1月第二军医大学东方肝胆外科医院、上海市同仁医院和镇江市第三人民医院部分慢性乙型肝炎(hepatitis B chronic， CHB)患者80例和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC) 50例患者血清和肝组织，以上患者均未曾进行过抗病毒治疗，诊断符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》的标准。乙肝组中男性52例，女性28例，年龄30～56岁，平均(42.4±10.62)岁;肝癌组中男性41例，女性9例，年龄45～67岁，平均(48±8.36)岁，两组间年龄差异无统计学意义。

　　1.2　主要材料

　　1.2.1　质粒和受体菌

　　本实验所用1.5拷贝HBV全基因组野生质粒(pHBV1.5，C型)由南京医科大学传染病研究中心葛国洪博士惠赠。大肠埃希菌DH5α由江苏大学基础医学与医学技术学院保存。HBV BCP区1762/1764双突变质粒由本课题组先期构建[18]。

　　1.2.2　试剂与仪器

　　大引物PCR定点诱变试剂盒、质粒提取回收试剂、PCR扩增系统为TaKaRa公司产品;PMD18T质粒载体、凝胶回收系统均购自宝生物(大连)有限公司。PCR仪、iCycler实时荧光定量PCR仪均为美国BioRad公司产品。

　　1.2.3　引物设计和序列测定

　　引物及探针设计采用Primer Premier 5.0软件，所有引物、探针的合成及序列的测定工作交由上海生工公司完成。

　　1.3　方　法

　　1.3.1　血液乙肝病毒DNA提取

　　抗凝或非抗凝血短暂离心，吸取上层血清或血浆100 μl，加入2%辛酸钠水溶液50 μl，混匀离心，100℃水浴15 min，18 000 r/min离心15 min，吸上清液待用。

　　1.3.2　肝组织样品乙肝病毒DNA的提取

　　肝穿刺组织或手术切取组织去除结缔组织，用NaCl-EDTA-Na2溶液洗去血液，粉碎后3 000 r/min离心10 min,60℃加入SDS溶液搅拌均匀，摇动30 min，使核酸和蛋白质分离;加入氯仿-异戊醇使之变性，吸取上清液，再次加入氯仿-异戊醇振摇20 min,4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，重复以上步骤，直到不出现蛋白层，吸取上清液，加入95%乙醇，4 000 r/min离心15 min，弃去上清液，80%乙醇洗涤沉淀物，真空干燥备用。

　　1.3.3　质粒标准品的制备

　　以紫外分光光度计分别测定PMD-HBV1.5-AG和PMD-HBV1.5-TA重组质粒浓度， 1 μg的质粒所含拷贝数为3.31×1011个，并稀释至每毫升含拷贝数107、106、105、104和103个。

　　1.3.4　特异性探针实时荧光定量PCR(PSRT-PCR)标准曲线的构建

　　设计PSRT-PCR所需引物，上游F ：5′-GTAACTCCACAGAAGCTCCAAAT-3′，下游R：5′-GTTGGGCACTTTGCCACAGGAAC-3′。设计定量检测HBV DNA的通用序列探针G：TAMRA>TGGCCTATGGGACTTATAAC 图1　重组质粒标准品扩增曲线

　　1.3.5　样本检测

　　将每份样本提取出的DNA进行PSRT-PCR检测。检测条件：95℃变性3 min,60℃退火4 min,72℃延伸5 min;然后再95℃变性30 s,60℃退火30 s， 72℃延伸30 s,50个循环。荧光采集点为72℃延伸段的最后10%。同时获得HBV DNA和双突变定量值。为确保实验数据的有效性，每次实验都以健康人血清为阴性对照，每个样本进行3次平行重复检测。分别抽取乙型肝炎组和肝癌组应用此方法检测BCP区1762/1764双突变阳性样本各10例，进行传统的测序，以验证此方法的特异性和敏感性。

　　2　结　果

　　成功制作了用于同时检测HBV DNA 和双突变拷贝量的TaqMan MGB探针。乙肝组和肝癌组各10例经PSRT-PCR方法检测阳性的标本，再次采用传统方法测序，均显示BCP区的A1762T/G1764A双突变，说明我们建立的PSRT-PCR法对BCP区双突变检测的正确率为100%。

　　对80例乙肝和50例肝癌患者分别予血清和肝组织双突变定量检测，肝癌组血清突变率(68.00%)明显高于乙肝组的血清突变率(41.25%)，两组间差异有统计学意义(χ2=8.815，P=0.003)。肝癌组肝组织突变率78.00%，乙肝组肝组织突变率为45.00%，两组间差异有统计学意义(χ2=13.728，P=0.000)。每组各自血清和肝组织突变率比较未见明显差异，见表1。

　　将乙肝组分为高病毒载量组(HBV DNA≥106/ml,43例)和低病毒载量组(HBV DNA<106/ml,37例)。检测结果显示，高病毒载量组血清和肝组织突变率均高于低病毒载量组，差异有统计学意义(P=0.001和P =0.001)。见表2。表1　乙肝组和肝癌组血清及肝组织双突变率的比较表2　乙肝组不同病毒载量患者血清和肝组织双突变率的比较

　　3　讨　论

　　乙型肝炎病毒突变尤其是BCP区1762/1764双突变与肝癌的发生可能密切相关。BCP区双突变的检测有多种方法。目前除了直接测序和传统的PCR-SSCP法之外，在现代分子生物学的基础上发展出了很多新的更加准确的和高通量的检测方法，例如基于高通量的基因芯片方法和基于定量PCR的熔点曲线等方法[19]。其他的方法还包括SOMA质谱法、毛细管电泳和pyrosequence法等，但是这些方法存在操作复杂、结果准确性不高和成本较高等缺点。另外有时在乙肝病毒突变株和野生株共存的情况下，已有的检测方法也不能定量分析这种野生株和突变株的比例。基于上述原因，开发一种准确快速、操作方便且价格低廉的乙肝病毒点突变监测方法具有重要的临床意义。

　　我们成功使用PSRT-PCR法检测了乙肝病毒HBV BCP区A1762T/G1764A双突变。结果显示，该方法可以准确检测突变株乙肝病毒的存在，同时可以定量分析突变株和野生株的比例，在足够多的阳性对照和标准品对照的情况下可以准确地进行野生株和突变株的绝对定量，从而能够在早期提供乙肝病毒突变的情况，为尽早改变乙肝病毒治疗方案和临床干预提供证据。同时本方法快速方便，其速度决定于PCR的速度，一般不超过2 h，操作简单，只要进行常规的实时荧光定量PCR过程即可，对于操作人员要求低，只要能够进行定量PCR操作的实验人员即可掌握，对仪器设备的要求低，只要配备双通道实时荧光定量PCR仪即可。

　　与普通的TaqMan探针相比，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高;而且TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

　　我们检测的结果显示，在未发生肝癌的慢性乙肝患者中，高病毒载量伴随着高双突变发生率。研究发现肝炎病毒的基因型和变异同预后和治疗密切相关[20]，其中BCP的变异是多位点和复杂的[21]， BCP区是富含AT区域，具有肝脏富含因子的转录结合点，变异的BCP可改变这种结合，降低前C的RNA转录，最终使HBeAg表达减少，BCP的变异还可使前基因组RNA转录增强，病毒包装有很大增强[22]，所以及早进行抗病毒等治疗有助于降低双突变发生率。

　　本实验结果显示，肝细胞癌患者BCP区双突变发生率明显高于慢性乙型肝炎患者，提示此双突变和肝癌的发生密切相关，检测此双突变有助于预测肝癌的发生。BCP区的1762/1764双突变同很多肝炎引起的肝脏疾病相关，例如重症肝炎、肝硬化和肝细胞癌，具有重要的临床意义。如果发生BCP区的1762/1764双突变，则意味着发生肝硬化和肝癌的可能性增大[23]，对这样的患者应密切注意肝炎的治疗和并发症的监测，应该更加密集地进行肝癌和肝硬化的体格检查，例如B超、CT和甲胎蛋白等检查。研究BCP区1762/1764双突变与肝癌发生的关系，有助于早期通过合理干预的方式防止已经发生突变患者发展为肝癌。

　　本实验结果表明，血清和肝组织双突变的检测结果具有良好的一致性，对于临床上无法进行肝脏穿刺或者手术的患者，可以通过血清的检测来反映肝脏病毒突变的情况，适合在临床推广应用。另一方面，血清检测阴性的患者不能完全排除双突变可能，对于一些抗病毒效果不理想而血清检测阴性的患者，可进行肝组织检测，以准确获知变异情况。

　　BCP双突变的检测可以预测肝癌的发生。但本实验检测已发生肝癌的慢性乙型肝炎患者中的BCP区1762/1764双突变是回顾性研究，如果进行前瞻性研究，早期明确研究目的，随访BCP区双突变的慢性乙型肝炎患者是否更易发生肝癌，得出的结果应该更具有说服力。

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