肝动脉桥式置管转流对供肝及胆道组织细胞凋亡的保护作用

　　作者：陆宏伟,黎一鸣,吉鸿,徐金锴　　作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院普通外科，陕西西安

　　【摘要】 目的 验证肝动脉桥式置管转流这一方法是否能够减轻肝动脉缺血(hepatic artery ischemia, HAI)引起的肝胆细胞凋亡。方法 应用简易犬肝自体原位移植模型，将24只杂交犬随机分为肝动脉缺血组(HAI组，8只)、肝动脉桥式置管转流组(TBB组，8只)及对照组(8只)。在制模后，3组动物均于冷灌注后不同时点切取肝脏、胆道组织，分别用戊二醛及40g/L多聚甲醛溶液固定，进行电镜观察和TUNEL染色，观察肝胆组织形态学改变及细胞凋亡情况，并计算两组的凋亡指数。结果 在冷灌注后2h，HAI组电镜下出现较明显的肝胆细胞凋亡现象;肝动脉桥式置管转流组肝胆细胞凋亡现象少见;对照组难以找到凋亡肝胆细胞。TUNEL法染色切片显示，冷灌注后3组肝胆组织内均有少量凋亡细胞，其凋亡指数相差不大(P>0.05);随冷灌注后时间的延长，3组凋亡细胞的数量均有所增加，但HAI组凋亡指数的升高更为显著，肝动脉桥式置管转流组次之，对照组变化不大，3组间差别有统计学意义(P<0.01)。结论 肝动脉桥式置管转流对肝移植时肝动脉缺血所导致的肝胆细胞凋亡具有显著保护作用，应在继续完善改进的基础上实施于临床。

　　【关键词】 原位肝移植;肝动脉缺血;肝动脉桥式置管转流;细胞凋亡

　　Protection value of transfering the blood by a bridging duct of hepatic artery on apoptosis in orthotopic liver transplantation

　　Lu Hongwei, Li Yiming, Ji Hong, Xu Jinkai

　　(Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To validate whether the method of transfering the blood by a bridging duct between the recipients spleen artery and the donors gastroduodenal artery can lessen the apoptosis of liver and bile duct caused by hepatic artery ischemia or not. Methods Altogether 24 crossfertilized dogs were divided into HAI group, transfering the blood by a bridging duct group (TBB group) and control group. After the models were induced, we cut the samples of liver and bile duct in all groups at different time points to fix in glutaraldehyde and 4% citromint and observed the apoptosis variety of liver and gall and calculated the apoptotic index. Results Two hours after cold perfusion, under electron microscope, apoptotic phenomenon could be easily observed in HAI group, singularly in TBB group, while almost none in control group. Slice staining by TUNEL showed that after cold perfusion each group had a few apoptotic cells, but there was no distinct difference in apoptotic index among the three groups. However, with the time prolonging after cold perfusion, although the quantities of the apoptotic cells increased in all groups, the index increased most distinct in HAI group, least in the control group, the TBB group took the middle, and apoptotic index differed notably (P<0.01). Conclusion Transfering the blood by a bridging duct of hepatic artery can lessen the apoptosis of liver and bile duct caused by HAI significantly. This method should be put in practice in clinic based on constant improvement.

　　KEY WORDS: orthotopic liver transplantation; hepatic artery ischemia; transfer blood; apoptosis

　　肝移植术目前已经成为治疗终末期肝脏疾病的重要手段。肝动脉吻合是肝移植手术过程中的一个技术难点，其吻合技术要求高、耗时长。美国哈佛大学医学院155例肝脏移植临床资料分析发现，当肝动脉缺血(hepatic artery ischemia, HAI)超过1h，术后早期并发症及胆道并发症的发生率分别由20%和0升至84%和36%[1]。同时，HAI尚可导致供肝细胞和胆道上皮细胞凋亡[2]，引起手术后供肝及胆道系统功能障碍。因此，缩短HAI时间，从而减轻HAI对肝胆组织的损伤并减少由此而引起的肝胆细胞凋亡，对肝移植的成功及术后肝功能恢复至关重要。我们拟通过本研究来验证通过肝动脉桥式置管转流这一方法是否能够达到这一目的。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 西安地区健康雄性杂交犬24只，平均犬龄15个月，体重(17.5±2.5)kg，毛色光亮，反应灵敏，由西安交通大学医学院第二附属医院外科动物实验室提供。动物随机分为肝动脉缺血组(HAI组)、桥式置管转流组(TBB组)和对照组，每组8只。

　　1.2 动物模型的制作 制模方法采用黎一鸣教授等人[3]报道的简易犬自体原位肝移植动物模型制作方法。该模型的建立方法如下：实验犬术前禁食12h，25g/L硫贲妥钠1mg/kg腹腔内注射诱导麻醉，气管插管后，1g/L氯胺酮静脉滴注维持。手术取上腹倒“Y”型切口进腹，充分解剖游离肝脏、肝外胆道、门静脉、肝动脉、肝上下腔静脉、肝下下腔静脉以及胃十二指肠动、静脉，并经胃十二指肠动、静脉分别置管，以准备灌注。胆囊造瘘，引流胆汁。以无损伤血管钳先后夹闭阻断肝动脉、门静脉、肝上和肝下下腔静脉，并在后者近端作1cm长的横切口，作为灌注液流出道。以4℃肝素乳酸林格氏液经置管同时灌注门静脉和肝动脉，灌注压力9.8kPa(1kPa=7.5mmHg),至流出液清亮、肝色变黄为止。肝表面温度降为4-10℃，热缺血时间3min，冷缺血时间15min。毕后，缝合下腔静脉切口，依次放开肝上、肝下下腔静脉。HAI组在门静脉开放2h后再开放肝动脉;肝动脉桥式置管转流组在冷灌注前分别向脾动脉及胃十二指肠动脉用双抗管插管，两管间用三通相连，建立肝动脉桥式置管转流装置，使脾动脉血流可经桥式置管转流通道经由胃十二指肠动脉管注入肝动脉。冷灌注之后，同时开放门静脉及桥式置管转流通道，使得门静脉与肝动脉同时获得血流灌注，血液再灌注后120min时，夹闭架桥管，开放肝动脉;对照组在冷灌注之后同时开放门静脉和肝动脉。3组均于冷灌注后0、1、2、3、4h时切取肝脏及肝外胆道组织标本，分别用戊二醛及40g/L多聚甲醛溶液固定。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 电镜观察 用西安交通大学医学院电镜室日立牌H600型透射电镜观察3组分别在不同时点肝细胞和胆道上皮细胞的凋亡情况。

　　1.3.2 凋亡指数 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TDTmediated dTUP nick end labeling, TUNEL)法[4]。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,严格按照说明书操作。细胞核染成棕黄色或棕褐色者为凋亡细胞。每张TUNEL标记切片在镜下(×400)，随机选5个视野，计数整个视野中的细胞数及凋亡阳性细胞数，用凋亡指数(apoptotic index, AI)表示各组的细胞凋亡情况(AI=凋亡阳性细胞数/整个视野细胞×100%)。

　　1.4 统计学处理 样本数据的统计描述采用±s的形式表示，3组均数之间的比较采用方差分析，并用SPSS10.0软件处理，P<0.05表示差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 3组的细胞凋亡情况 冷灌注后，在电镜下难以找到凋亡的肝细胞及胆道上皮细胞。HAI组2h出现较多凋亡的肝胆细胞，表现为细胞皱缩、变小变圆，胞浆浓缩，与邻近正常细胞脱离接触，与周围细胞间的紧密连结消失，细胞核固缩，染色质边集、浓染，凝集至核膜周边，呈月芽斑块状;当肝动脉开放后2h，肝胆组织凋亡细胞的数量增多，形态更为典型。肝动脉桥式置管组肝胆细胞凋亡数量少于HAI组，且多为早期改变的凋亡细胞，随时间的延长其凋亡细胞数量有所增多。对照组在各时刻点凋亡细胞少见。

　　2.2 3组肝胆细胞凋亡指数的比较 冷灌注后，3组肝胆组织内均有少量凋亡肝细胞，其凋亡指数相差不大(P>0.05);随门静脉开放时间的延长，HAI组和肝动脉桥式置管转流组凋亡细胞的数量均有所增加(P<0.01)，但HAI组凋亡指数的升高幅度较肝动脉桥式置管转流组更为显著，两组间差别显著(P<0.01);对照组在门静脉开放后各时点其凋亡指数变化不大(P>0.05)。

　　Fig.1 Apoptosis of hepatic cell under transmission electron microscope ×5000

　　The apoptotic cells shrank, became small and round, the cytoplasm condensed, deviated from the normal cells nearby, tight link with other cells vanished, the karyon shrank, the chromatins clumped at the periphery of karyolemma and seemed semilunar

　　Fig.2 Apoptosis of biliary epithelial cell under transmission electron microscope ×5000

　　The apoptotic cells shrank, became small and round, the cytoplasm condensed, deviated from the normal cells nearby, tight link with other cells vanished, the karyon shrank, the chromatins clumped at the periphery of karyolemma

　　Table 1 Apoptotic index of hepatic cells

　　△P<0.01, vs. HAI group; ▲P<0.01, compared at each time point after portal vein revascularized among 3 groups; #P<0.05, vs. after cold perfusion in control group

　　Table 2 Apoptotic index of biliary epithelial cells(n=8, ±s, %)

　　△P<0.01, vs. HAI group; ▲P<0.01, compared at each time point after portal vein revascularized among 3 groups; #P<0.05, vs. after cold perfusion in control group

　　Fig.3 Apoptosis of hepatic cell 4h after opening the potal vein in HAI group (TUNEL ×400)

　　The karyon dyed into buffy or brown meant apoptotic cell

　　Fig.4 Apoptosis of hepatic cell 2h after opening the hepatic artery in TBB group (TUNEL ×400)

　　The karyon dyed into buffy or brown meant apoptotic cell

　　Fig.5 Apoptosis of biliary epithelial cell 4h after opening the potal vein in HAI group (TUNEL ×400)

　　The karyon dyed into buffy or brown meant apoptotic cell

　　Fig.6 Apoptosis of biliary epithelial cell 2h after opening the hepatic artery in TBB group (TUNEL ×400)

　　The karyon dyed into buffy or brown meant apoptotic cell

　　3 讨论

　　本实验所采用的简易犬自体原位肝移植模型具有以下特点：①手术操作较为简单、手术损伤小、入肝血流阻断完全、无肝期肝脏灌注彻底、肝脏经历了类似移植手术中冷、热缺血及再灌注损伤，具有较好的模拟性;②排除了肝移植中因血管吻合所致的并发症;③消除了同种异体间移植排斥反应;④肝动脉缺血时间可精确控制，增加了组间的可比性;⑤由于无需血管吻合，所以无肝期明显缩短，减轻了无肝期时全身血流动力学变化所造成的机体影响。

　　由于排除了各种影响实验结果的干扰因素，该实验结果能客观地反映HAI在肝移植中的作用及脾胃十二指肠动脉架桥对其作用的影响。

　　从理论上讲，在肝移植过程中存在两次缺血再灌注损伤，即冷灌注后门静脉开放所导致的冷缺血再灌注损伤以及随后肝动脉开放所导致的热缺血再灌注损伤。Natori S等[5]研究证实，在肝移植过程中，肝脏冷缺血和热缺血均可诱导肝脏窦内皮细胞和肝细胞的凋亡。我们在实验中也证实了这一结果。因为我们在实验中严格地控制了冷缺血时间，故在本实验中，热缺血再灌注对肝胆组织的损伤及对肝胆细胞凋亡的诱导作用要强于冷缺血再灌注。通过肝动脉桥式置管转流，能显著减少肝胆细胞的凋亡指数，但仍多于对照组。这说明在本实验中肝动脉缺血时间的长短和程度的强弱是导致细胞凋亡的主要原因，而且桥式置管转流能够显著的减轻肝动脉缺血的程度。

　　目前，对肝动脉缺血导致肝胆组织细胞凋亡的机理尚不十分清楚。Motoyama S等[6]认为，过氧化氢等氧自由基大量生成是肝脏缺血再灌注损伤的主要原因。这可能是因为门静脉开放后，随着肝脏复温、耗氧量增加，肝组织特别是肝动脉系统供血的组织(如肝内外胆道组织)仍处于明显的热缺血、缺氧状态，导致组织细胞内氧自由基大量生成，使肝动脉系统供血的组织更易受损。国内学者相关实验证实[2]，在肝移植过程中随肝动脉缺血时间的延长，肝组织中Bcl2蛋白的表达逐渐降低，NO的含量逐渐减少。相关研究发现，肝细胞分泌的NO对肝组织细胞凋亡有明显的保护作用[7]，供肝组织中内源性NO生成水平降低与肝组织细胞凋亡的发生有密切关系，而且补充外源性NO可抑制凋亡发生[8]。此外，NO在细胞内的信号转导途径与细胞凋亡的信号传递通路相互联系[9]，可通过影响P53、Bcl2和caspase3等基因的表达来促进或抑制细胞凋亡发生。Bcl2主要功能是通过直接抗氧化、抑制线粒体释放促进凋亡蛋白、抑制Bax的细胞毒作用和抑制caspase激活等机制促进细胞生存、延长细胞寿命、抑制细胞凋亡[10]。所以，肝动脉缺血时Bcl2蛋白表达的减少也是诱导肝胆细胞凋亡增加的原因之一。虽然凋亡的肝细胞不发生细胞内容物的外漏，但当凋亡肝细胞数量显著升高时，肝细胞功能必然受到影响，肝细胞凋亡的增加显然不利于再灌注后肝功能的恢复，而且随着再灌注时间延长，凋亡细胞尚可能进一步引发肝细胞坏死性改变[11]。

　　同时，我们在实验中还发现，肝动脉缺血对胆道组织的影响程度要明显强于肝脏组织。虽然缩短肝动脉缺血时间或降低肝动脉缺血程度可减少肝胆细胞的凋亡指数，但通过数据可以发现，到实验结束时为止，利用肝动脉桥式置管转流使供肝细胞凋亡指数由(11.32±1.17)%降为(5.87±0.54)%，而胆道上皮细胞的凋亡指数由(12.89±1.02)%降为(2.56±0.58)%。我们认为这一问题的原因是肝脏组织有双重血供，肝动脉缺血时，肝细胞血供可通过门静脉血流增多而得以部分代偿，从而在一定程度上减轻了肝动脉缺血的损伤作用;而肝内、外胆道组织的血液供应主要来自于肝动脉，尤其在肝移植中，供肝切取后，来自供体胃十二指肠动脉的上行支被切断，所以供肝胆道组织血供几乎全部来自于肝动脉，所以肝动脉缺血时间的长短及缺血程度的高低对胆道系统的影响更为直接、显著。本实验模型为了严格模拟肝移植的实际情况，在制模时充分游离了肝外胆道，并在十二指肠上方离断了胆总管，从而切断了胃十二指肠动脉供应胆道系统的上行支。所以，本实验结果能确切地反映肝动脉缺血对胆道细胞凋亡的影响。

　　本实验证实肝动脉桥式置管对于预防肝动脉缺血再灌注损伤的效果显著。该方法能明显减轻HAI对肝、胆组织细胞凋亡的诱导作用，为过渡到临床应用奠定了实验学基础。但是，仍不能达到对照组因同时开通门静脉和肝动脉而彻底排除了肝动脉缺血再灌注损伤对实验结果影响的那种理想的最佳状态。原因是肝动脉桥式置管转流仅能在一定程度上满足肝动脉系统血供情况，而对照组那种理想的最佳状态可以看作肝动脉桥式置管的一种极限状态。在研究工作中，只要我们不断的改进实验方法，运用血流加压泵等设备，就能使之无限地接近这一理想状态。我们认为这一方法在肝移植中有着良好的的应用前景，相信它一定会在肝移植的过程中发挥积极的作用。

　　【参考文献】

　　[1]Li YM, Jenkins RL, Lewis WD. The primary observation and approach to effects of hepatic artery on the results of liver transplantation [J]. J Xian Med Univ, 1993, 5(2):8190.

　　[2]黎一鸣，徐心，吉鸿，等. 兔肝动脉缺血对肝细胞凋亡的影响及其机制研究 [J]. 肝脏, 2002, 7(1):2021.

　　[3]黎一鸣，秦兆寅，康亚安，等. 简易犬自体肝原位移植模型建立及意义 [J]. 中华实验外科杂志, 1995, 12(2):113114.

　　[4]Gavrieli Y, Sherman Y, BenSasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labling of nuclear DNA fragmention [J]. J Cell Biol, 1992, 119(3):493501.

　　[5]Natori S, Selzner M, Valentino KL, et al. Apoptosis of sinusoidal endothelial cells occurs during liver preservation injury by a caspasedependent mechanism [J]. Transplantation, 1999, 68(1):8996.

　　[6]Hines IN, Harada H, Wolf R, et al. Superoxide and postischemic liver injury: potential therapeutic target for liver transplantation [J]. Curr Med Chem, 2003, 10(24):26612667.

　　[7]Farghali H, Canova N, Kucera T, et al. Nitric oxide synthase inhibitors modulate lipopolysaccharideinduced hepatocyte injury: dissociation between in vivo and in vitro effects [J]. Int Immunopharmacol, 2003, 3(12):16271638.

　　[8]吴天鸣，杨翔，高志刚，等. 一氧化氮对大鼠肝缺血再灌注损伤中肝细胞凋亡的影响[J].中华实验外科杂志, 2001, 18(3):225227.

　　[9]Das A, Xi L, Kukreja RC. Phosphodiesterase5 inhibitor sildenafil preconditions adult cardiac myocytes against necrosis and apoptosis. Essential role of nitric oxide signaling [J]. J Biol Chem, 2005, 280(13):1294412955.

　　[10]Ramalho RM, CortezPinto H, Castro RE, et al. Apoptosis and Bcl2 expression in the livers of patients with steatohepatitis [J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2006, 18(1):2129.

　　[11]Togo S, Kubota T, Matsuo K, et al. Mechanism of liver failure after hepatectomy [J]. Nippon Geka Gakkai Zasshi, 2004, 105(10):658663.