胆管癌中MRP1和GSTπ的表达及临床意义

　　作者：安杰，刘伟，耿建英　　作者单位：石家庄市，中国人民解放军白求恩国际和平医院病理科，普通肝胆外科

　　【摘要】 　　目的 多药耐药性(MDR)是导致胆管癌化疗疗效不佳的主要原因，本研究通过检测胆管癌组织中MRP1和GSTπ的表达情况，探讨其耐药的临床意义。方法 收集2001年1至2007年12月收治并行手术切除的21例胆管癌标本，RTPCR方法检测标本中MRP1及GSTπ mRNA的表达。结果 MRP1和GSTπ mRNA在胆管癌组织中的表达阳性率分别76.2%和66.7%，显著高于对照组(P<0.05)，上述指标与性别、年龄、病理分期、分化程度、淋巴结转移均无关(P>0.05)。结论 MRP1、GSTπ基因在未经过化疗的胆管癌组织中均有不同程度的高表达;胆管癌的原发性多药耐药可能与MRP1、GSTπ有关。

　　【关键词】 胆管癌 多药耐药相关蛋白 谷胱苷肽S转移酶π

　　Expression of multidrug resistancerelated genes MRP1 /GSTπ in carcinoma of cholangiocarcinoma and its significance 　　AN Jie，LIU Wei，GENG Jianying.　　Department of Pathology，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050082，China

　　【Abstract】 Objective Multidrug resistance is the main cause for the patients with cholangiocarcinoma for not responding to chemotherapy.To investigate the gene expression of multidrug resistancerelated protein 1(MRP1)，glutathione Stransferaseπ(GSTπ)in cholangiocarcinoma in order to explore the clinical significance of multidrug resistance.Methods The expression of MRP1 and GSTπ in 21 cases of cholangiocarcinoma was measured by RTPCR method，while 8 cases of choledochitis served as the control group.Results The positive rates of MRP1，GSTπ mRNA in cholangiocarcinoma were 76.2%，66.7% respectively，which were significantly higher than those of control group(P<0.05).Their expressions were not related to gender，age，staging，differentiation and lymph node metastasis(P>0.05).Conclusion MRP1 and GSTπ are overexpressed in various degrees of cholangiocarcinoma without chemotherapy，which may be related to the primary multidrug resistance of the tumors.

　　【Key words】 cholangiocarcinoma;multidrug resistancerelated protein;glutathione S transferaseπ

　　多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指当一种药物作用于肿瘤细胞使之产生耐受性后，该肿瘤对未接触过的、结构无关、机制不同的肿瘤药物也具有耐受性，产生交叉耐药。MDR是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的细胞防御机制，也是造成化疗失败的主要原因。与胃肠道肿瘤相比，胆管癌对化疗药物敏感性尤差，迄今为止仍缺少成熟有效的化疗方案[1-3]。多药耐药的机制很复杂，已知的包括MDR1/Pgp、多药耐药相关蛋白(multidrug resistant associated protein，MRP)、肺耐药相关蛋白(lung resistance related protein，LRP)以及谷胱甘肽S转移酶π(glutathione S conjugate transportπ，GSTπ)均在肿瘤耐药方面扮演重要的角色。本实验通过免疫组织化学的方法检测胆管癌组织中MRP1和GSTπ的表达情况，分析其与胆管癌的临床病理特征之间的关系，探讨它们与临床上胆管癌化疗敏感性的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集本院2001年1月至2007年12月手术切除的胆管癌21例(胆管癌组，包括肝门胆管癌14例、肝外胆管癌7例)的石蜡标本，其中男8例，女13例;年龄35～77岁，平均年龄55.5岁。按照TNM分期：Ⅰ期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期6例、Ⅳ期1例，所有病例术前未行化疗。另取8例胆管炎症标本为良性对照组(对照组)。2组年龄、性别比等差异无统计学意义(P<0.05)。

　　1.2 试剂

　　Trizol抽提试剂(Roche公司)，RTPCR试剂盒(Promega)，操作步骤按试剂盒说明进行。

　　1.3 方法与步骤

　　RTPCR检测提取液氮速冻标本细胞RNA，引物序列由上海生工生物工程服务有限公司合成。MRP1 PCR引物：A，5’AGTTCTGCGGTGCTGTTGTG3’;B，5’TTCGCTGAGTTCCTGCGTAC3’;GSTπ PCR引物：C，5’GTGCCTTCACATAGTCATCCTTGC3’;D，5’CCGTGGTCTATT TCCCAGTTCG3’。内参βactin引物序列：5’GGCATCGTGATGGACTCCG3’;5’GCT GGAAGGTGGACAGCGA3’。PCR参数设置：42℃条件下45 min行逆转录后进行PCR：MRP1引物为A、B(退火温度为58℃)，GSTπ引物为C、D(退火温度为60℃)。反应条件：94℃变性3 min，94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环。阴性对照除不加模板外，其他各种成分与待检样品相同。各样本βactin作为内对照。 RTPCR最终产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.4 结果检测及评定

　　RTPCR凝胶电泳后以Quality One 凝胶成像及分析系统进行观察和分析。MRP1 mRNA表达阳性者可见218 bp 条带，GSTπmRNA表达阳性者可见354 bp 条带，βactin扩增产物为613 bp，βactin阳性样本视为有效样本。靶条带/βactin>0.1为阳性表达，靶条带/βactin<0.1为阴性表达。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS 11.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 胆管癌组织中MRP1和GSTπmRNA表达

　　MRP1 mRNA阳性者可见218 bp条带，GSTπmRNA阳性者可见354 bp条带，βactin扩增产物为613 bp(图1)。MRP1、GSTπmRNA在胆管癌组织中的表达阳性率分别为76.2 %(16/21)、66.7%(14/21);在对照组组织中的表达阳性率分别为25%(2/8)和12.5%(1/8)，MRP1、GSTπmRNA在胆管癌组组织中的表达阳性率显著高于对照组(P<0.05)。MRP1和GSTπ mRNA在胆管癌及对照组中的表达

　　2.2 MRP1和GSTπmRNA表达与临床病理分期的关系

　　MRP1和GSTπmRNA在胆管癌组织中的表达与性别、年龄、病理分期、分化程度和有无淋巴结转移等因素无相关性(P>0.05)。MRP1和GSTπmRNA在胆管癌组织中表达的阳性率分别为：76.2%(16/21)、66.7%(14/21)。MRP1和GSTπmRNA在胆管癌组织中的表达具有良好的正相关性，Spearman系数分别为0.169(P<0.05)和0.147(P<0.01)。 MRP1和GSTπ mRNA在胆管癌组织中的表达与临床病理分期的关系

　　3 讨论

　　化疗是目前治疗肿瘤最有力、最常用的手段，而MDR 现象却是造成治疗失败的主要因素，对MDR的研究成为近年来肿瘤领域的热点。肿瘤耐药的原因多种多样：Pgp的过表达，MRP表达的增加，谷胱甘肽相关酶的改变，拓朴异构酶Ⅱ的改变，蛋白酶C的变化等均参与其中。

　　相对于胃癌、直肠癌等消化道肿瘤而言，胆管癌对于化疗药物的敏感性更差。吴舟锋等[4]通过体外实验研究发现：肝门部胆管癌对多种抗癌药物的敏感性如下：表阿霉素为58%(14/24)，阿霉素、卡铂均为54%(13/24)，顺铂为50%(12/24)，氟脲嘧啶为17%(4/24)，甲氨喋呤为4%(1/24)，参照比较胃癌、结肠癌对于同类药物敏感性数据，说明胆管癌对临床常用的化疗药物耐药性更强，而多药耐药是造成这种结果的主要原因。多药耐药相关蛋白(MRP)是除MDR1/Pgp外一个重要的MDR机制。MRP1是从小细胞肺癌H69/AR耐药细胞系中克隆出的耐药相关基因表达的蛋白，广泛分布在各种正常组织和肿瘤组织中。MRP1与Pgp同属ABC超家族膜转运蛋白，主要通过转运GSX复合物及参与胞质囊泡运输，介导阿霉素、长春新碱和VP16等的耐药[5]。GSTπ对抗肿瘤药物同样具有解毒作用，其作用机制则不同于Pgp：GSTπ能通过酶蛋白自身的氧化清除机制清除抗癌药物在体内产生O-3、H2O2、羟自由基等活性氧或自由基，从而防止药物代谢生成的活性氧类物质对膜磷脂的损伤;氧化型GSTπ还可再经转硫酶被GST重新还原成带SH基的活性型酶，从而实现氧化还原形态的循环利用。GSTπ还可以催化还原型谷胱甘肽与亲电子性药物非共价结合成GSX复合物，再转运出胞外而解毒，从而使肿瘤细胞对某些化疗药物的抗性升高，导致化疗的失败，由此看出GSTπ和MRP在抗癌机制方面具有明确的功能联系。国内外学者在胃癌、结直肠癌、骨肉瘤等恶性肿瘤中均发现GSTπ直接或间接引起MDR[6，7]。临床研究证实：GST阳性往往提示对顺铂、多柔比星、环磷酰胺等药疗效不佳，而应用谷胱甘肽合成酶抑制剂(BSO)能够逆转人肺腺癌多药耐药细胞株A549/DDP对后顺氯氨铂(DDP)和阿霉素(ADM)的耐药[8]。

　　本实验采用RTPCR方法检测MRP1和GSTπ在未经化疗的胆管癌组织中的表达水平，结果显示：MRP1、GSTπmRNA在胆管癌组织中的表达阳性率分别为76.2%(16/21)、66.7%(14/21);显著高于对照组;MRP1和GSTπmRNA在胆管癌组织中的表达呈现明显正相关性，说明GSTπ作用发挥与MRP，Pgp等膜转运蛋白发挥药物外排泵功能相关[9]，提示在胆管癌组织中MRP1和GSTπ的过表达在胆管癌多药耐药方面起着重要的协同作用;而胆管癌MDR的机制非常复杂，存在多种机制、多个因素参与调控，不能用单一的元素来解释。我们是否可以将二者作为胆管组织恶变的标志物，这有待与今后进一步的实验和论证。本实验还发现MRP1和GSTπ的表达与患者性别、年龄、临床分期、分化程度、有无淋巴结转移没有相关性(P>0.05)，提示：临床病理分期的相关指标只能代表肿瘤的恶性程度，并不能反映肿瘤对化疗药物的耐受能力。

　　罗剑等[10]应用携带人p27kip1基因的重组腺病毒载体转染人胆管癌细胞系QBC939，转染后5Fu、MMC和CTX对QBC939细胞生长抑制率显著增加，细胞凋亡率也明显升高。另一项研究发现：磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002作用于胆管癌细胞系QBC939后，5FU、MMC及塞莱西布对QBC939抑制作用明显增强，且能提高其凋亡率，上述研究为针对肿瘤耐药的靶向性治疗提供了新的思路。鉴于此，通过检测多个MDR基因产物在胆管癌组织中的表达情况并检测化疗药物敏感性，依据个体的差异制定和调整化疗方案，配合应用耐药逆转药物治疗对于提高胆管癌临床疗效有重要意义。

　　【参考文献】

　　1 QayyumA，MujtabaI.Effects of chemotherapy on patients with unresectable or metastatic adenocarcinoma of gallbladder.J Pak Med Assoc，2007，57：7174.

　　2 Young LC，Camp Ling BG，Cole SP，et al.Multidrug resistance proteins MRP3，MRP1，and MRP2 in lung cancer.Chin Cancer Res，2001，7：17981840.

　　3 Shi JS，Wang Jian S.Progress in chemotherapy of cancer of bile ducts.J Post Med，2001，24：810.

　　4 吴舟锋，王炳生，刘继国，等.肝门部胆管癌术后选择抗癌药物的体外实验研究.中华普通外科杂志，2000，6：335337.

　　5 Loe DW，Deeley RG，Cole SP.Biology of the multidrug resistanceassociated protein，MRP.Eur J Cancer，1996，32：945957.

　　6 Wei L，Song XR，Wang XW，et al.Expression of MDR1 and GSTpi in osteosarcoma and soft tissue sarcoma and their correlation with chemotherapy resistance.Chin J Cancer，2006，28：445448.

　　7 Chen WY，Mao WM，Zhao L，et al.Expression of Pgp，GSTpi and TopoII alpha in gastric and colorectal cancers and their clinical significance.Chin J Cancer，2005，27：738740.

　　8 万一元，贾正飞，仲琴，等.BSO逆转人肺腺癌细胞株多药耐药性的实验研究.徐州医学院学报，2005，3：195199.

　　9 Muller M，Meijer C，Zaman GJ，et al.Overexpression of the encoding the multidrug resistance associated protein results in increased ATP dependent glutathione S conjugate transport.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：1202213037.

　　10 罗剑，曹治华，刘民锋，等.p27kip1基因在人胆管癌细胞化疗增敏效应中的作用.华中科技大学学报(医学版)，2006，3：67.