冠状动脉粥样硬化组织环氧化物酶2、诱导型前列腺素合成酶1表达及塞来昔布的影响

　　作者：李新华,刘恒方,杨期东,苗旺 作者单位：1.郑州大学第五附属医院心内科, 河南 郑州 450052　2.中南大学湘雅医院神经内科, 湖南 长沙 410008

　　【摘要】 目的 探讨兔冠状动脉粥样硬化组织环氧化物酶2(Cox2)、诱导型前列腺素合成酶1(mPGES1)表达机制及塞来昔布对其表达的影响。方法 采用32只雄性新西兰大白兔，正常对照组8只(A组);另24只将给予1%高胆固醇喂养2周，建立兔动脉粥样硬化动物模型。将模型兔随机分为无干预组(B组)、小剂量塞来昔布治疗组(15 mg/kg，C组)，大剂量塞来昔布治疗组(35 mg/kg，D组)，每组8只。治疗4周后取双侧冠状动脉并分为平等2段，分别行半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及蛋白印记法(Western blot)测定各组冠状动脉粥样硬化组织Cox2及mPGES1表达。结果 与A组比较，B 组冠状动脉粥样硬化组织Cox2及mPGES1表达增高，差异具有统计学意义(P<0.05);与B组比较，C、D组冠状动脉组织的Cox2及mPGES1表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较，C组的ALD明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 在动脉粥样硬化的病理过程中炎症反应可能起着主导作用，塞来昔布干预可抑制Cox2及mPGES1表达，减缓动脉粥样硬化的进展。

　　【关键词】 塞来昔布,动脉粥样硬化,环氧化物酶2,诱导型前列腺素合成酶1

　　Abstract：Objective To explore the effects of Celecoxib on the expression of cyclooxygenase type 2 (Cox2) and membrane associated prostagladin E1(mPGES1) in the rabbit coronary artery atherosclerotic tissue. Methods Thirtytwo male New Zealand white rabbits were randomly assigned into 4 groups: blank control group (group A), model group(group B), minidose Celecoxibtreated group(group C),large dose Celecoxibtreatedg roup (group D), rabbits in group B, C and D group were fed with 1% cholesterol diet for 2 weeks.Rabbits in groups C were subsequently treated with minidose Celecoxib (15mg/kg/day) and rabbits in group D with large dose Celecoxib (35mg/kg/day) for 4 weeks;Coronary arteries were excised after 4 weeks of treatment. The collected coronary arteries were equally dissected into 2 sections. Cox2 and mPGES1 expressions of coronary artery were evaluated by RTPCR and western blot. Results There were significant down regulations of Cox2 and mPGES1 gene expressions (P<0.05) in group C and group D than in group B. Conclusions Celecoxib can downregulate Cox2 and mPGES1gene expressions, mitigate inflammation in atherosclerotic tissue, and slow down the process of atherosclerotic plaque formation.

　　Key words：Celecoxib; Atherosclerosis; Cyclooxygenase type 2; Membrane associated prostagladin E1

　　环氧化物酶2(cyclooxygenase2,Cox2)及诱导型前列腺素合成酶1(membrane associated prostaglandin E ，mPGES1)从多个方面影响动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)进程[1,2] 。本实验将采用超选择性Cox2抑制剂干预动脉粥样硬化性模型兔，检测模型兔冠状动脉的Cox2、mPGES1表达，探讨Cox2、mPGES1诱导的炎性反应机制在冠状AS形成中作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物和分组

　　新西兰雄性大白兔32只(由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供);1%高胆固醇颗粒饲料由中南大学湘雅医学院实验动物中心配置;塞来昔布(辉瑞公司产)。32只新西兰大白兔，体重(2.0±0.22)kg，适应性喂养1周，随机分为4组,每组8只， A组：正常对照组予以正常颗粒饲料喂养;模型分组如下：B组：无药物干预组;C组：小剂量塞来昔布干预组(15 mg/kg，2次/d);D组：大剂量塞来昔布干预组(35 mg/kg，2次/d)，灌胃法给药4周。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制作及组织取材

　　模型兔给于1%高胆固醇颗粒饲料喂养2周，给药至4周末(即高脂6周)处死动物，取出冠状动脉左主干，左前降支，左旋支及右冠状动脉，剥净动脉外膜的周围脂肪，平分为2等份，其中1份15%的中性甲醛固定，石蜡切片，HE染色，光镜观察组织学改变。另一份置入-196℃液氮中待测。病理学方法证实粥样硬化性冠状AS模型制作成功[3,5]。

　　1.2.2 细胞总RNA的提取及RTPCR

　　冠状动脉组织按文献[6]法提取总RNA，磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参照。采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)公司的一步反应法完成RTPCR反应。Cox2的引物：上游：5′GGT GGA GAT GAT CTA CCC GC3′;下游： 5′ GGT TGA AAA GCA GCT CTG GG 3′，产物片断151 bp;mPGES1引物5′ GCA GCG CAC TGC TGG TTC TGA AGA 3′;下游： 5′AGA CCA GGC CCA GGA AGA GGA AA 3′，产物片断210 bp;GAPDH引物上游：5′ AGG GTC ATC ATC TCA GCC CC 3′;下游：5′ ATG CCT GCT TCA CCA CCT TC 3′，445 bp;RTPCR反应条件： Cox2：逆转录反应50℃ 30 min，94℃预变性2 min，94℃变性35 s，55℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃终延伸10 min;mPGES1的RTPCR反应条件： RT反应50 ℃30 min，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55℃延伸45 s，72℃延伸45 s，共32个循环，72 ℃终延伸10 min。RTPCR反应体系均为25 μL。取PCR产物2 μL经1.0%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色, 应用美国Eagle EyeII型凝胶图像软件分析系统进行定量分析，用目的基因的吸光度值与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。

　　1.2.3 冠状动脉组织Cox2及mPGES1 蛋白质表达

　　冠状动脉组织中加入三去污剂裂解缓冲液进行组织细胞裂解，于4℃、14 000 r/min离心30 min，弃除沉淀，lowry法进行蛋白定量，取50 μg蛋白加入2× SDS凝胶加样缓冲液中，在100℃加热10 min使蛋白质变性。用7% SDS聚丙烯酞胺凝胶进行电泳分离，转PDVF膜，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白分子量标准位置。封闭液封闭2小时，按1:200加入一抗(均为1:200稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗3次，1:2000加入辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗，室温孵育1 h，TBST洗3次，转移至X光胶片。结果用Labwork凝胶图像分析系统对胶片扫描，以目标蛋白面积灰度值与实验组进行比较和半定量分析。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS12.0统计软件分析，半定量RTPCR和Western blot结果采用方差分析，进一步两两比较采用q检验(StudentNewmanKeuls法)P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 冠状AS组织Cox2及mPGES1 mRNA的表达

　　与A组比较，B组冠状AS组织Cox2 mRNA和mPGES1 mRNA表达显著上调，差异有统计学意义( P<0.01);与B组比较，C、D组明显下调，差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较，D组下调差异无统计学意义(P>0.05)见表1，图1、2。表1 各组动物的C0X2 mRNA及mPGES1 (略)mRNA表达水平(n=8)注：与A组比较，aP<0.05;与B组比较，bP<0.05

　　2.2 冠状AS组织Cox2及mPGES1 蛋白质的表达

　　与A组比较，B 、C、D组Cox2及mPGES1 蛋白质表达水平上调，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较，C、D组Cox2及mPGES1 蛋白质表达水平下调，差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较，D组Cox2及mPGES1 蛋白质表达下调差异无统计学意义(P>0.05)见表2及图3、4。表2各组动物的C0X2 及mPGES1蛋白表达(略)注：与A组比较，aP<0.05;与B组比较，bP<0.05;

　　3 讨论

　　环氧化酶[1,2] (cyclooxygenase,Cox)主要催化花生四烯酸转化为前列腺素G2(PGG2)和有生物活性的最终产物，譬如PGD2、PGE2、PGF2、PGI2、TXA2等。在多数组织的生理状态下Cox2基因以极低拷贝数表达，只有当细胞接受相应的刺激时Cox2才开始大量表达。 mPGES1是PGE2合成的关键限速酶，与Cox2共同定位。近年来，研究[4]表明Cox2 及mPGES1与AS性疾病关系密切。有学者把AS本身也看作是一种炎症反应过程， 认为炎症释放的细胞因子可诱导和表达Cox2/mPGES1,加速AS的进程并导致AS斑块的增大和脱落。免疫组化技术研究发现CAS斑块mPGES1有强烈的免疫活性，症状性斑块的mPGES1的蛋白也为高水平表达。本实验A组仅检测到Cox2 mRNA与mPGES1 mRNA及其蛋白的微弱表达;B、C、D组冠状AS组织Cox2 mRNA与mPGES1 mRNA及蛋白表达水平有不同程度的上调。与空白对照组比较，尽管动物模型给予塞来昔布干预，但是Cox2 mRNA与mPGES1 mRNA及其蛋白仍呈高水平表达。表明冠状动脉发生AS改变后，其Cox2/mPGES1基因诱导的炎症机制在冠状AS的病理过程中可能起着重要的作用。

　　免疫组化技术研究证实AS早期阶段炎症反应刺激释放的细胞因子诱导Cox2/mPGES1大量表达，引起炎症反应的放大增强。超选择Cox2抑制剂通过降低血管炎症反应产生抗炎效果，有助于提高AS斑块的稳定性。有学者[1]给健康的受试者服用Cox2抑制剂后，发现有抗AS的作用。服用Cox2抑制剂后有增加心血管事件风险的报道，可能为冠状动脉发生AS改变后诱发炎症的放大效应，导致心肌细胞的凋亡。本实验通过塞来昔布干预冠状AS模型兔后发现Cox2 mRNA及mPGES1 mRNA表达水平下调，其蛋白表达水平也相应下调，表明塞来昔布可使冠状AS的Cox2/mPGES1表达水平下调。大剂量塞来昔布应用并未见Cox2 mRNA与mPGES1 mRNA及蛋白表达水平呈现量效关系，暗示小剂量的超选择Cox2抑制剂的应用可间接降低冠状AS的炎性反应程度，延缓冠状AS损害的进程。

　　【参考文献】

　　[1]Burleigh ME, Babaev VR, Oates JA, et al. Cyclooxygenase2 promotes early atherosclerotic lesion formation in LDL receptor deficient mice[J]. Circulation,2002,105: 18161823.

　　[2]Von Der Thusen JH, Kuiper J, Van Berkel TJ, et al. Interleukins in atherosclerosis: molecular pathways and therapeutic potential[J]. Pharmacol Rev,2005, 55: 133166.

　　[3]刘恒方，李新华，杨期东，等.改良硅橡胶圈加高胆固醇喂养诱导颈动脉狭窄兔模型的建立[J].中国实用神经疾病杂志，2007，10：1719.

　　[4]刘恒方，杨期东，朱晓岩，等.通心络、辛伐他丁对兔颈动脉粥样硬化斑块ABCA1表达的影响 [J].卒中与神经疾病，2006，13：332334.

　　[5]刘恒方，黄晓松，刘尊敬. 颈动脉狭窄动物模型的研究进展[J]. 国际神经病学神经外科学杂志，2006，33：6265.