胰腺癌Syk表达与病理分期及血管生成的相关性

　　作者：张红雨,费立明,王长亮,赵文华,张波　　作者单位：山东大学齐鲁医院干部保健科， 济南

　　【摘要】 目的 研究胰腺癌中Syk的表达及其与病理分期、血管生成的关系。方法 收集胰腺癌组织40例，另选9例慢性胰腺炎、8例正常胰腺组织标本为对照。应用免疫组织化学方法和RTPCR检测Syk蛋白的表达，形态计量学图象分析法测定微血管密度(MVD)。结果 慢性胰腺炎标本中Syk阳性率为77.8%(7/9), 8例正常胰腺组织中Syk全部阳性表达;Syk蛋白在胰腺癌组织中呈低表达，阳性率为27.5%(11/40);Syk阳性率与肿瘤的发生部位无关，而与TNM分期、分化程度和淋巴结转移有关(P均<0.05)。PCR结果显示Syk在胰腺癌中呈低表达(P<0.01)。MVD与胰腺癌的组织分化程度、TNM分期相关(P<0.01)，胰腺癌组织中Syk蛋白表达阴性者MVD高于阳性者(P=0.000)。结论 Syk在胰腺癌中表达减低或缺失，与胰腺癌的发展相关，可能参与胰腺癌的血管生成和淋巴结转移的过程。

　　【关键词】 脾酪氨酸激酶;血管生成;病理学;胰腺肿瘤

　　3. Shandong Tumor Hospital, Jinan 250117, China)

　　To study the expression of Syk and its correlations with clinical pathology and angiogenesis in pancreatic adenocarcinoma (PAC). Methods Forty PAC, 9 chronic pancreatitis and 8 normal pancreatic tissues were collected. The expressions of Syk protein in these tissues were assayed by immunohistochemical staining, and also expressions of Syk mRNA in PAC were investigated by realtime PCR. MVD marked by CD34 was detected by morphometric analysis, and the relationship between MVD and clinical pathology of PAC was analyzed. Results The positivity rate of Syk protein in PAC, chronic pancreatitis and normal pancreatic tissues was 27.5%, 77.8% and 100%, respectively. There were 29 samples with negative Syk protein, and among them the Syk levels had no relations to the cancer position, but had relations to the TNM classification, tumor differentiation and lymphotic metastasis(P<0.05). The MVD was higher in positive Syk proteins than in negative ones (P=0.000). Conclusions The expression of Syk in pancreatic cancer is significantly lower than that in chronic pancreatitis and normal pancreatic tissues and is related to the development of pancreatic cancer. MVD has significant relationship with differentiation and histology types of PAC.

　　Key words: Spleen tyrosine kinase; Angiogenesis; Pathology; Pancreatic neoplasms

　　蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)是一组能催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的酶蛋白，参与许多信号转导途径，并在控制细胞分化、增殖和扩散中起重要作用。迄今发现90余种PTKs具有癌基因功能，而脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)是唯一具有抑癌作用的PTK。Syk的表达与肿瘤的侵袭及转移密切相关[1]，我们以前初步研究[2]了Syk在胰腺癌中的表达情况，在此基础上，本研究分析Syk在胰腺癌中的表达及其与临床病理的关系，探讨Syk在胰腺癌血管生成中的作用及意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本 山东省肿瘤医院2005～2007年手术获得的胰腺癌标本40例，诊断标准按照UICC胰腺癌TNM分期(2002版)。所有标本的获取均获患者知情同意。男25例，女15例，30～72岁，平均55.6岁。胰头癌31例，胰体、尾癌9例。病理检查：管状腺癌32例，乳头状腺癌6例，囊腺癌、腺泡细胞癌各1例; 高、中分化22例，低分化18例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期32例。所有病例术前均未作放疗和化疗，并记录40例胰腺癌的临床病理资料。另选9例慢性胰腺炎(山东省肿瘤医院)，8例正常胰腺组织标本(山东大学医学院解剖教研室)为对照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学法 采用SP法对标本中Syk蛋白的表达水平进行检测。鼠抗人Syk单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司(Neo Markers); CD34单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司(DAKO Cytomation, Glostrup, Denmark);SP试剂盒购自福州迈新公司。用已知的阳性标本作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。操作步骤按试剂盒说明进行。

　　Syk以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每例切片至少计数10个400倍视野。阳性细胞数：<10%(-)，11%～25%(+)，26%～50%(+〖KG-*3]+)，>50%(+〖KG-*3]+〖KG-*3]+)。染色强度判定：不着色(-)，浅棕黄色(+)，棕黄色(+〖KG-*3]+)，棕褐色(+〖KG-*3]+〖KG-*3]+)。综合阳性细胞数和染色强度分析染色结果。

　　采用抗CD34单克隆抗体标记微血管内皮细胞。先在100倍视野下全面观察切片，寻找微血管高密度区，再在400倍视野下观察，以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分有明显区别的、任何一个染成棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇作为一个微血管，只要结构不相连，其分枝结构也作为一个血管进行计数;但管腔>8个红细胞大小或带有肌层的血管均不计数。记录5个高倍视野内的微血管数，取其平均值作为每例的微血管密度(microvessel density, MVD)。所有免疫组化染色切片由两位病理科医师分别双盲阅片。

　　1.2.2 RTPCR 利用Trizol试剂盒提取总RNA, 测定RNA纯度及浓度并对其完整性进行检测, 以总RNA为模板,经逆转录得到cDNA。Syk的PCR引物序列，上游引物：5′AAGCAAATGTCATGCAGCAG3′，下游引物：5′TCATCCCTCGATATGGCTTC3′，产物片段为471?bp。以人βactin为内参照，其上游引物：5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,下游引物：5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3′，产物片段为317?bp。扩增条件为：94?℃变性 45?s;58?℃退火45?s;72?℃延伸45?s;共35个循环，最后72?℃延伸7?min。PCR 产物在加溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳, 于紫外线灯下观察结果、照相, 并进行图像分析, 分析后的积分光度值均以同一样本中相应的βactin积分光度值校正,以反映标本中Syk的相对含量。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件行χ2检验、Fisher确切概率法检验、t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Syk蛋白表达及与胰腺癌临床病理的关系 Syk蛋白主要位于细胞质，呈棕黄色颗粒状染色;9例慢性胰腺炎标本中7例Syk蛋白阳性,8例正常胰腺组织均呈阳性表达。而40例胰腺癌组织中11例阳性，低于其他两种组织(P均<0.01)。

　　40例胰腺癌组织中Syk与肿瘤的发生部位无关，Syk蛋白的表达与胰腺癌的分化程度(P=0.012)、TNM分期(P=0.042)和淋巴结转移(P=0.020)有关。

　　胰腺腺泡中Syk阳性表达(SP法，×100)

　　2.2 RTPCR检测Syk的表达情况 Syk mRNA在正常胰腺组织中呈中等表达状态(0.526±0.087)，在胰腺癌中低表达(0.174±0.143)，两者差异具有统计学意义(P<0.01)。Syk mRNA在慢性胰腺炎组织呈中等表达状态(0.518±0.025)，与胰腺癌组织比较有统计学差异(P<0.01)。

　　2.3 MVD胰腺癌的临床病理关系 免疫组织化学染色中CD34主要位于微血管内皮细胞，胰腺癌组织中微血管形态不规整，分布不均;癌灶边缘血管较密集，成簇状，部分呈发芽状，管腔相对规则，但微血管分布不均。形态计量学图象分析法测定MVD发现，胰腺癌中/低分化者MVD显著高于高分

　　胰腺癌组织中微血管内皮细胞CD34阳性(SP法，×100)

　　Fig.3 Positive expression of CD34 in microvessel cells(SP，×100)化者(P<0.01)，TNM Ⅲ～Ⅳ期中MVD也显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.01)，提示MVD与胰腺癌的组织学分化程度、TNM分期显著相关，而淋巴结转移阳性和阴性者中MVD并无明显变化(P>0.05)。

　　2.4 Syk蛋白的表达与MVD之间的关系 40例胰腺癌组织中29例Syk蛋白阴性表达者的MVD显著高于Syk蛋白阳性者(P=0.000)，提示胰腺癌中Syk蛋白的低表达或表达缺失与肿瘤微血管生成的增加密切相关，肿瘤中微血管增加也为胰腺癌的生长与进展提供了条件。

　　3 讨 论

　　Syk是一种非受体酪氨酸激酶，在淋巴细胞发展及免疫细胞活化过程中起着极为重要的作用[35]。Takano等[6]认为，Syk基因是一种候选抑癌基因，其表达产物Syk的缺失会导致免疫细胞发育、成熟障碍，从而对突变、异常增生的细胞失去免疫监视功能，导致肿瘤的发生。Coopman 等[1]发现，Syk是促进乳腺上皮细胞生长的强力因子，在正常乳腺腺体、上皮组织及非侵袭性乳腺癌细胞中很容易检测到Syk的表达，而在侵袭性乳腺癌细胞中则表达降低或缺失。Syk蛋白在非侵袭性乳腺癌细胞中的表达可被催化激活，因为从这些细胞中分离出来的Syk可在体外的酶试验中自磷酸化。这些结果表明，Syk表达的缺失可能与正常乳腺组织向恶性型发展有关。宋玉琴等[2]的研究证实，Syk的缺失可能与胰腺癌的发生和转移有关。

　　本研究发现，在胰腺正常组织中可检测到Syk，而在胰腺癌组织中检测率很低，表明Syk表达的缺失可能与胰腺癌的发生有关。本组40例胰腺癌组织中Syk蛋白的表达与肿瘤部位无关，而与TNM分期、分化程度和有无淋巴结转移显著相关，说明Syk的表达减低或缺失在胰腺癌的进展过程中起重要作用。

　　Carter等[7]认为Syk与HER2/neu是一对功能相反的抑癌/癌基因，HER2/neu的过度表达可诱导血管内皮细胞收缩，从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障发生转移，而作为肿瘤的抑制剂，Syk可以抑制HER2/neu收缩血管内皮细胞。Wang等[8]报道，Syk细胞核转录过程是Syk抑制肿瘤功能的限速步骤，mut Syk激活了转录因子Sp1和Sp1介导的FRA1转录过程，进而使相应的基因发生转录激活和产物表达。Chakraborty等[9]发现，在MCF细胞中Syk/Lck通过Sp1途径引起VEGF的表达显著增加。

　　本研究表明，Syk蛋白的表达与MVD有显著相关性，提示胰腺癌中Syk蛋白的低表达或表达缺失与肿瘤的微血管生成的增加密切相关，肿瘤中微血管增加也为胰腺癌的生长与发展提供了条件。但本研究样本数量有限，尚需进一步扩大样本量进行验证。

　　【参考文献】

　　[1] Coopman P J, Do M T, Barth M, et al. The Syk tyrosine kinase suppresses malignant growth of human breast cancer cells[J]. Nature, 2000， 406(6797):742747.

　　[2] 宋玉琴, 周武元, 赵文华, 等. Syk蛋白在胰腺癌中的表达及临床意义[J].中华肿瘤防治杂志,2007, 14(15):11491151.

　　[3] Turner M, Schweighoffer E, Colucci F, et al. Tyrosine kinase SYK: essential functions for immunoreceptor signaling[J]. Immunol Today, 2000, 21(3):148154.

　　[4] Law C L, Sidorenko S P, Chandran K A, et al. Molecular cloning of human Syk. A B cell proteintyrosine kinase associated with the surface immunoglobulin MB cell receptor complex[J]. J Biol Chem, 1994, 269(16):1231012319.

　　[5] Abtahian F, Guerriero A, Sebzda E, et al. Regulation of blood and lymphatic vascular separation by signaling proteins SLP76 and Syk[J]. Science, 2003, 299(5604):247251.

　　[6] Takano T, Sada K, Yamamura H. Role of proteintyrosine kinase syk in oxidative stress signaling in B cells[J]. Antioxid Redox Signal, 2002, 4(3):533541.

　　[7] Carter W B, Hoying J B, Boswell C, et al . HER2/neu overexpression induces endothelial cell retraction[J]. Int J Cancer, 2001, 91(3):295299.

　　[8] Wang L, Devarajan E, He J, et al. Transcription repressor activity of spleen tyrosine kinase mediates breast tumor suppression[J]. Cancer Res, 2005, 65(22):1028910297.

　　[9] Chakraborty G, Rangaswami H, Jain S, et al. Hypoxia regulates crosstalk between Syk and Lck leading to breast cancer progression and angiogenesis[J]. J Biol Chem, 2006, 281(16):1132211331.