门静脉高压症患者脾切除后外周血B7-1/CD28表达的变化

　　作者：严国度,谭玉林,奚剑波,戚传平,汤寅,法　　作者单位：江苏大学附属武进医院 肝胆外科，江苏 常州 213002

　　【摘要】 目的 探讨B7-1/CD28对门静脉高压症(portal hypertension，PHT)患者免疫功能的影响和作用。方法 采用流式细胞分析技术对30例门静脉高压症患者进行研究，检测门静脉高压症患者行脾切除前后外周血淋巴细胞中以及脾脏中B7-1/CD28的表达情况，分析其与患者淋巴细胞亚群以及免疫功能的关系。对患者外周血B7-1/CD28和淋巴细胞进行检测。利用免疫组化方法检测B7-1/CD28在脾脏中的表达，与10例外伤性脾破裂行脾切除之脾脏组织进行比较。结果 门静脉高压症患者外周血中淋巴细胞亚群和B7-1/CD28表达较低，脾切除后短期内升高。其脾脏中表达的B7-1/CD28较正常人群高。结论 门静脉高压症患者全脾切除后外周血B7-1/CD28通路被激活，患者免疫功能得到部分恢复。

　　【关键词】 高血压，门静脉;B7-1;CD28;脾切除

　　Expression changes of B7-1/CD28 in peripheral blood lymphocytes of patients with portal hypertension after splenectomy YAN Guodu， TAN Yulin， XI Jianbo， et al. Department of Hepatobiliary Surgery， Wujin Hospital， Affiliated to Jiangsu University， Changzhou 213002

　　Abstract Objective To study the effect of B7-1/CD28 on immunological function in patients of portal hypertension after appendectomy. Methods The data of thirty patients with portal hypertension and ten traumatic patients were analyzed. The changes of CD20， CD4， CD8， CD4/CD8 and B7-1/CD28 in the peripheral blood were detected by FCM and B7-1/CD28 in spleen was detected with immunohistochemisty. The relationships between them were investigated. Results The expression of CD20， CD4， CD8， CD4/CD8， B7-1/CD28 in the peripheral blood lymphocytes decreased. They recovered in short time after appendectomy. Conclusion The pathway of B7-1/CD28 is activated after splenectomy and the immunological function of PHT patients recovers partly.

　　Key words hypertension， portal; B7-1; CD28; splenectomy

　　脾脏是人体最大的淋巴组织，是重要的外周免疫器官，对机体多个系统有调节作用。门静脉高压症患者巨脾是一种慢性淤血性脾肿大，目前对于其切除还是部分保留存在争议，本研究就门静脉高压症患者切除巨脾后B7-1/CD28的变化以及T淋巴细胞亚群的变化探讨其免疫功能的变化。

　　1 材料和方法

　　1.1 临床资料 门静脉高压患者30例，均为本院2004年3月-2006年10月的住院患者，经临床和病理确诊。其中女12例，男18例，年龄43～67岁，平均年龄51.2岁。所有患者未外用免疫治疗，并抽取外周血。对照组均为健康正常人群。

　　1.2 材料 小鼠抗人单克隆抗体CD3，CD4，CD8，B7-1，CD28，CD19及阴性对照单抗均购于美国PharMingen公司;血清免疫球蛋白检测用试剂IgA， IgG，IgM购于Sigma司;Partec流式细胞购于德国，酶标仪Elx800购于BIQ TEK公司。

　　1.3 样本采集及处理 所有受试对象采集静脉血8 ml，其中5 ml EDTAK2抗凝，室温保存，在24 h内用于流式细胞仪进行分析，3 ml分离血清4℃保存，用于血清免疫球蛋白测定。

　　1.4 流式细胞仪分析 各管加入抗体后加入充分混匀的100 μl抗凝全血，室温避光孵育20 min各管用2 ml的1×FACS溶血剂避光溶血10 min，加300 μl含1%多聚甲醛的PBS重悬后上机检测，采用Flomax软件进行数据分析，每份标本分析5 000个细胞。在散点图上设门确定淋巴细胞的分布位置，计算出CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3+CD4+CD28+，CD3+CD8+CD28+，B7-1+CD19+细胞占淋巴细胞的百分率和其荧光表达强度。

　　1.5 血清免疫球蛋白水平测定 每个样本分离出血清保存于-20℃，根据试剂盒说明书操作测定血清 IgA、IgG、IgM的含量。

　　1.6 B7-1/CD28表达的检测 脾组织制成石蜡切片，SP法免疫组织化学行B7-1/CD28表达的检测。随机观察5个视野(×200)，细胞膜黄染者为阳性细胞，取均数为阳性细胞数。

　　1.7 统计学方法 免疫组化和流式细胞仪分析的实验数据采用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0数据分析系统，两组进行独立样本t检验。

　　2 结果

　　PHT患者脾脏切除术前与术后T淋巴细胞CD4+、CD4+/CD8+以及CD8+数，外周血B淋巴细胞及血清中免疫球蛋白的水平，外周血T细胞上B7-1/CD28的表达情况。

　　PHT患者脾脏与外伤性脾脏B7-1/CD28免疫组化结果。

　　3 讨论

　　T细胞的完全活化需要两个信号途径。抗原与抗原提呈细胞上人类相关抗原(MHC)分子构成的复合物与T细胞受体相结合为T细胞活化提供了第一信号，随后在协同刺激因子CD28/B7提供的第二信号作用下使T细胞完全活化[1]。B7-1属免疫球蛋白超家族成员，是B细胞活化抗原，CD28是B7-1的配体，CD28与B7-1的结合可同时引起T细胞和B细胞的活化，在T、B细胞协作中发挥重要作用。我们研究发现PHT患者外周血T细胞总数与正常对照组比较有显著下降，且T细胞亚群有明显的改变，CD4+T细胞和CD8+T细胞明显降低，提示患者细胞免疫功能紊乱，且T细胞亚群是以CD4+T辅助细胞功能亢进为主。CD28分子表达于几乎所有的CD4+T细胞[2]，所以CD4+T细胞数量下降必然导致CD28表达下降，结合APC上表达的B7-1分子起到正相调控作用，活化的APC又可通过B7途径使T细胞CD40+表达下降，进一步激活T细胞数减少。CD8+T细胞在数量上明显低于正常对照组，但其CD28的表达却仍然高于健康对照组，提示CD8+T细胞的数量降低，但其功能处于失活状态。一方面，CD28是活化T细胞最重要的膜分子，它与APC上表达的相应配基分子B7-1相结合，经CD28转导活化信号，增强T细胞对抗原应答，由B7-1/CD28发出第二信号，增强细胞因子基因的转录，不能增强IL-2基因转录及其mRNA的稳定性，反而使T细胞增殖下降[3]：另一方面，由下降的B7-1/CD28发出的信号，减少Bcl-xL的表达，导致T细胞凋亡[4]。由于以上两个方面的原因，患者外周血T细胞表面CD28表达率显著降低(与正常对照组比较，P<0.01)。T细胞活化后，还表达另一种表面分子，即CTLA-4，其胞浆区具有ITIM基序，它与B7-1结合，但它与CD28的作用相反，向T细胞发出抑制信号，使活化的T细胞的子代细胞对抗原刺激的敏感性降低，从而限制T细胞应答在一定的范围，导致门静脉高压症患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均显著降低，引起免疫功能的下降。

　　门静脉高压症患者免疫调节紊乱还表现在B淋巴细胞活动性的降低，从本实验可见，PHT患者的3种免疫球蛋白IgA，IgG和IgM水平较正常对照组显著降低(P<0.05)。这是因为活化T细胞介导的CD28信号可促使表达B7-1的B细胞克隆转化和抗体产生减少，并可导致成熟B细胞表面膜免疫球蛋白诱导凋亡蛋白表达下降，使成熟B细胞凋亡，活化成熟B细胞向细胞外分泌大量的免疫球蛋白相应减少，导致血清中免疫球蛋白浓度显著下降。所以笔者认为，门静脉高压症患者的免疫功能较正常人群是降低的。

　　通过门静脉高压症患者脾脏切除术后T淋巴细胞的变化以及外周血B淋巴细胞及血清中免疫球蛋白水平的对比，我们发现，脾切除后短时期内患者的免疫功能是提高的，其机制可能是门静脉高压症患者由于长期的胃肠道淤血，细菌的移位，造成内毒素血症以及大量的抗原流经脾脏，对脾脏产生刺激。我们推测，在门静脉高压条件下有可能也同时表达B7分子，从而发挥抗原提呈作用。本研究发现，门静脉高压症患者脾脏B7-1/CD28比正常人外伤性脾脏的表达显著增加。该结果表明，在门静脉高压症患者中，脾脏内的抗原提呈细胞通过表达B7-1使浸润的T细胞活化，触发和扩大局部的免疫损伤。

　　门静脉高压症患者的免疫功能明显降低，与外周血的B7-1/CD28通路有着密切的关系，因为B7-1/CD28的作用是转导T细胞激活所必需的共刺激信号，同时在免疫维持和下调中起非常重要的作用。以往的研究证实，门静脉高压症患者外周血单核细胞来源的CD数量减少，功能下降，MHC-II类分子、黏附分子表达减少，细胞因子分泌异常[5]。有研究表明，门静脉高压症患者体内树突状细胞功能明显低下，抗原提呈能力不足，不能将抗原提呈给机体的免疫系统以发挥正常的免疫功能。其重要的环节之一就是Th细胞在接受抗原信号和协同刺激信号B7-1/CD28后活化、增殖以及分化的过程发生障碍。通过研究结果证实了门静脉高压症患者存在这一问题。

　　本研究就门静脉高压症患者的免疫功能作了初步探讨，在实际临床中影响其免疫功能的原因有很多方面，而B7-1/CD28通路在其中起了重要的作用，其机制还应做进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1] Wang SD， Chen LP. Co-signaling molecules of the B7-CD28 family in positive and negative regulation of T lymphocyte response[J]. Microbes Infec，2004，6(8)：759-766.

　　[2] Jones RL， Young LS， Hubscher SG， et al. Expression and function of costimulatory molecules in human hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Hepatology，2000，32(Supple 2)：165.

　　[3] Carreno BM， Collins M. The B7 family of ligands and its receptors： new pathways for costimulation and inhibition of immune response[J]. Annu Rev Immunol，2002，20(1)：29-53.

　　[4] Sharpe AH， Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nat Rev Immunol，2002，2(2)：116-126.

　　[5] Razi-Wolf Z， Freeman GJ， Galvin F， et al. Expression and function of the murine B7 antigen， the major costimulatory molecule expressed by periboneal exudate cells[J]. Pro Natl Acad Sci USA，1992，89(9)：4210-4219.