抑肽酶对凝血酶所致星形胶质细胞损伤的保护作用

　　作者：江承平　李毅　刘福　吴碧华　王晓明　何效平　马英 作者单位：637000　四川南充，川北医学院附属医院药剂科(江承平、李毅、刘福、何效平)，神经内科(吴碧华、王晓明、马英)

　　【摘要】 目的　观察抑肽酶对凝血酶所致大鼠星形胶质细胞损伤的保护作用。方法　将体外培养的大鼠星形胶质细胞随机分为正常对照组、凝血酶组及抑肽酶干预组。24 h后，测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法比较细胞损伤程度(OD值)。用末端脱氧核糖核苷酸转移介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测不同抑肽酶浓度作用培养星形胶质细胞后的凋亡细胞。结果　抑肽酶干预组的OD值(0.67±0.11,0.78±0.07和0.80±0.13)高于凝血酶组的OD值(1.05±0.09)(P<0.05);抑肽酶干预组的LDH活力(154.31±10.74、101.38±13.59和92.72±11.92)明显低于凝血酶组的LDH活力(267.09±25.35)(P<0.05)。抑肽酶干预组的星形胶质细胞凋亡数(13.20±1.52、9.10±1.20和4.80±0.89)明显低于凝血酶组星形胶质细胞凋亡数(26.10±1.82)(P<0.05)。结论　抑肽酶可能是通过减轻凝血酶诱导星形胶质细胞损伤并增加其活力、减轻其凋亡，对其实施保护作用。

　　【关键词】 抑肽酶,凝血酶,星形细胞,细胞培养技术;　大鼠

　　【Abstract】　Objective　To observe the protective effect of aprotinin on astrocytes damaged by thrombin. Methods　Cultured astrocytes of rats were divided into five groups randomly，normal control group， thrombin group and aprotinin pretreatment group. After twenty-four hours， the activity of lactate dehydrogenase was determined by chemistry reaction in the culture system. The viability of astrocytes (OD value) was measured by methylthiazolyl tetrazolium (MTT). The apoptotic cells in different aprotinin concentrations were detecte by TUNEL.Results　the OD values in the intervention groups of aprotinin (0.67±0.11， 0.78±0.07 and 0.80±0.13) were higher than the thrombin group (1.05±0.09) (P<0.05); The LDH activities in the intervention groups of aprotinin (154.31±10.74， 101.38±13.59 and 92.72±11.92) were significantly lower than the thrombin group (267.09±25.35) (P<0.05).The apoptotic cells in the intervention groups of aprotinin (13.20±1.52， 9.10±1.20 and 4.80±0.89) was significantly lower than the thrombin group (26.10±1.82) (P<0.05).Conclusions　Aprotinin can alleviate the astrocytes damage induced by thrombin by increasing viability and decrease apoptosis of astrocytes， to achieve its protective effect.

　　【Key words】　Aprotinin;　Thrombin;　Astrocytes;　Cell culture techniques;　Rats

　　近年来，随着对脑出血病理生理研究的深入，凝血酶在脑出血急性期病理性损伤中的作用引起诸多学者的关注，其对脑组织的损伤主要是通过破坏血-脑脊液屏障，直接作用于神经细胞导致神经细胞发生不同程度的损伤和凋亡反应，具体表现为血肿周围的细胞发生水肿、退化、功能丧失直至死亡[1]。正常生理条件下，星形胶质细胞是神经细胞之间的支持成分，它向神经细胞提供支持、隔离、营养、清洁和防御作用。抑肽酶是从牛肺组织中提取的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，临床上常用于大手术如体外循环、肝脏移植时的保护，与凝血酶有一定的拮抗作用但又不影响机体的凝血功能。本实验以培养的大鼠脑皮质星形胶质细胞为实验对象，从体外直接观察抑肽酶抑制凝血酶对星形胶质细胞的毒性作用。

　　材料与方法

　　1. 实验动物、主要试剂和器材：出生后1 d的Wistar大鼠50只，体重15～18 g，分别分成5组(正常组、凝血酶组、抑肽酶小、中、大剂量组)，购自川北医学院实验动物中心，许可证号SCXK(川2008-18);抑肽酶为Amresco公司产品;凝血酶购自Sigma公司;DMEM-F12培养基、Hanks液购自Gibco公司，胰蛋白酶购自Hyclone公司，细胞培养板为美国COSTAR公司产品;胎牛血清(FBS)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司;四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium， MTT)、酚酞蓝，美国Sigma公司;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购于南京建成生物制剂公司;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)，北京化工厂;TUNEL检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);CO2培养箱，美国Sheldon公司;超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;XD-101型倒置显微镜，上海光学仪器厂;GeNios DNA Expert型酶联免疫检测仪，奥地利Tecan公司;GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。

　　2. 大鼠星形胶质细胞的分离、培养及鉴定：星形胶质细胞的培养参照McCarthy和De Vellis的方法[2]。出生后1 d的Wistar大鼠6只，雌雄不拘。无菌操作下取双侧皮层，剪碎， 0.25%胰蛋白酶消化(37 ℃， 30 min)，反复吸打，在离心机半径为 15 cm、离心速度为1000 r/min的情况下离心5 min，收集细胞，37 ℃孵育1 h，差速贴壁去除成纤维细胞，调整细胞密度为10×104个/ml，于含10%胎牛血清DMEM-F12培养基培养。3 d更换一次培养基，培养9 d，细胞长至80%～90%融合后，置于37 ℃ 摇床中振荡2次，在同样离心机半径情况下离心(250 r/min，第1次：12～14 h;第2次：30～60 min)，得到较纯化的星形胶质细胞。用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)染色进行鉴定，纯度达90%以上即可用于实验。

　　3. MTT法检测抑肽酶对星形胶质细胞活性的影响：纯化后的细胞以Hank′s液洗涤1次，0.25%胰蛋白酶消化后，用0.4%酚酞蓝染液染色，计活细胞率(蓝染率<10%)及细胞数，以10%FBS DMEM-F12培养液稀释细胞成1×104个/ml，加入96孔培养板，每孔200 μl;培养48 h后随机分组并吸弃原培养液，分为正常对照组(加入200 μl 10% FBS DMEM-F12培养液)、凝血酶组(加入用10% FBS DMEM-F12培养液配制的终浓度为100 U/ml凝血酶200 μl)、抑肽酶小剂量组(加入用10% FBS DMEM-F12培养液配制的终浓度为100 U/ml凝血酶、100 U/ml抑肽酶200 μl)、抑肽酶中剂量组(加入用10% FBS DMEM-F12培养液配制的终浓度为100 U/ml凝血酶、200 U/ml抑肽酶200 μl)、抑肽酶大剂量组(加入用10% FBS DMEM-F12培养液配制的终浓度为100 U/ml凝血酶、400 U/ml抑肽酶200 μl)、每组均设9个复孔;每组并设无细胞调零孔;37 ℃，5% CO2 培养箱中培养48 h，每孔加20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，同样条件下培养4 h,2000 r/min、5 min 离心后吸弃上清液，每孔加200 μl DMSO，振荡5 min，酶联免疫检测仪570 nm处测定吸光度值(OD值)，实验重复3次。吸光度值的大小反映星形胶质细胞成活数量及活性。

　　4. LDH测定：将纯化的星形胶质细胞经消化、离心、0.4%酚酞蓝染液染色，计活细胞率(蓝染率<10%)及细胞数计数后接种于24孔培养板中，每孔接种细胞2 ml(1×104个/ml)，培养48 h后同MTT法分组，每组5个复孔。24 h后按试剂盒说明书对上清液测定LDH活力。

　　5. 细胞凋亡的检测：大鼠星形胶质细胞按同源、相同数量分组，传代培养至第3代，按接种密度为1×105个/ml种于12孔培养板中，置37 ℃，5% CO2培养箱孵育6 d，然后进行分组处理，孵育24 h，用TUNEL法进行凋亡细胞的测定。

　　6. 统计学方法：数据以均数±标准差(x-±s)表示，采用SPSS 10.0统计软件进行分析，组间差异采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用LSD法，取α=0.05为检验水准。

　　结　　果

　　1. MTT法检测抑肽酶对星形胶质细胞活性的影响(表1)：结果显示，凝血酶组的OD值最小，即对细胞损伤大，对细胞有抑制作用，细胞存活率显著降低;而加入一定浓度的抑肽酶后，OD值逐渐增加，呈剂量依赖性，即细胞活性呈明显上升趋势。与凝血酶组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。表1　抑肽酶对星形胶质细胞活性的影响

　　2. LDH测定(表2)：结果显示，凝血酶组LDH值较正常组显著升高(P<0.05)，抑肽酶组LDH值与凝血酶组相比显著降低(P<0.05)。抑肽酶引起星形胶质细胞培养上清液中LDH活性呈剂量依赖性降低，提示抑肽酶对凝血酶诱导的星形胶质细胞有一定的保护作用。表2　抑肽酶对培养细胞上清液中LDH的影响

　　3. 凝血酶和抑肽酶对星形胶质细胞凋亡的影响(表3，图1～3)：凝血酶组的凋亡细胞数较正常对照组显著增加(P<0.05);抑肽酶组与凝血酶组相比显著降低(P<0.05) ，提示在抑肽酶干预下，凋亡细胞减少，呈剂量依赖性降低。表3　10个视野的平均TUNEL阳性细胞数

　　讨　　论

　　颅内出血后短期内在血肿周围有大量的凝血酶产生，而目前研究认为凝血酶在颅内出血后的早期脑水肿形成过程中起主导作用，还可通过激活PAR-1(protease-activated receptor-1)增强NMDA受体的敏感性，增强了谷氨酸介导的神经细胞死亡。星形胶质细胞是中枢神经系统内数量众多的一大类神经细胞群体，起营养支持的星形胶质细胞不但具有分泌功能，以及保证神经细胞的正常发育、生存和分化，而且在神经突触发生、突触传递的调节和突触可塑性中发挥极为重要的功能[3]。星形胶质细胞分泌大量可扩散的神经营养因子和非扩散的神经细胞支持物质，如促进轴突生长的糖蛋白、神经营养因子膜结合分子、细胞黏附分子层黏蛋白对神经细胞起一定的营养作用，星形胶质细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，提高纹状体γ-氨基丁酸(GABA)能神经细胞轴突生长可能通过启动即早基因c-fos的表达，释放的生长因子可拮抗小胶质细胞对神经细胞的毒性。

　　凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，脑出血后血液凝固产生大量的凝血酶，而神经细胞、胶质细胞等暴露在高浓度的凝血酶中。有研究表明，极微量的凝血酶即可使神经细胞和神经胶质细胞凋亡[4-5]。脑损伤后的病理生理改变多伴有缺血、缺氧，而神经细胞的缺血缺氧损伤是一个启动神经毒性的循序的级联损伤反应。近来研究表明凝血酶在血管外通过激活蛋白酶激活受体PARs (protease-activated receptors)、PAR-1、PAR-3和PAR-4在脑缺血、脑出血和脑外伤中的重要作用已越来越清楚，若将形态上与胶质细胞相似的C6胶质瘤细胞进行培养，加入不同量的凝血酶，24 h后测培养液中标志细胞损伤的LDH浓度，结果LDH浓度随凝血酶量的增加而升高，证实了凝血酶对脑细胞的毒性作用[6-8]。LDH 是一种细胞内标记酶，其生物和化学性质十分稳定，通常情况下神经细胞LDH漏出较少，当细胞受损时，细胞膜通透性发生改变，因此LDH释放的多少可反映细胞受损的程度[9]，多年来，LDH被用来代表神经细胞细胞的损伤程度和胞膜对LDH的通透性[10]。

　　选用大鼠脑皮质星形胶质细胞培养模型，研究表明，凝血酶对细胞有抑制作用，不同程度的突起缩短，细胞出现肿胀，甚至崩解，随凝血酶剂量的增大，上述变化更明显，并出现大量细胞碎片。我们选用大鼠脑皮质星形胶质细胞培养模型，发现一定 (1～100 U/ml)的浓度范围会引起星形胶质细胞不同程度的突起缩短，细胞出现肿胀，甚至崩解，随凝血酶剂量的增大，上述变化更明显，并出现大量细胞碎片，TUNEL 阳性细胞呈逐渐增加的趋势，用MTT法测得的OD570值呈剂量依赖性降低趋势，培养上清液LDH活性呈剂量依赖性升高，提示随凝血酶剂量的增大，它对星形胶质细胞的毒性作用相应增加。抑肽酶能促进星型胶质细胞生长，OD570值呈剂量依赖性增加，还能明显抑制凝血酶诱导的LDH释放，且随抑肽酶浓度的增加，LDH活性相应降低，细胞损害减轻，凋亡细胞数减少(P<0.05)，提示抑肽酶对凝血酶诱导的星形胶质细胞有一定的保护作用。

　　本研究系体外实验，星形胶质细胞虽作为脑内功能细胞中较为重要的一种，但要较全面地阐述抑肽酶和凝血酶在脑出血中的作用和机制，尚需进行更深入的研究。

　　(本文图片见光盘)

　　【参考文献】

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　　[7]　Nakamura T，Xi G，Park JW，et al. Holo-transferrin and thrombin can interact to cause brain damage.Stroke,2005,36(2)：348-352.

　　[8]　Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 induction after experimental intracerebral hemorrhage.J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(1)：55-61.

　　[9]　Hong SS，Gibney GT，Esquilin M，et al.Effect of protein kinases on lactate dehydrogenase activity in cortical neurons during hypoxia.Brain Res,2004,1009(1/2)：195-202.

　　[10]　Zhang J，Qian H，Zhao P，et al.Rapid hypoxia preconditioning protects cortical neurons from glutamate toxicity through delta-opioid receptor.Stroke,2006,37(4)：1094-1099.