肿瘤干细胞学说与肝癌的相关研究进展

　　作者：许刚 作者单位：524001 广东湛江, 广东医学院附属医院肝胆外科

　　肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，在我国每年大约有25万人死于肝癌，位居恶性肿瘤死亡率的第二位，是严重威胁人们健康乃至生命的恶性疾病。目前对肝癌的治疗主要有手术、放疗、化疗及生物治疗等，总体治疗效果不佳。近年肿瘤干细胞(tumor stem cells,TSC)学说备受人们关注，认为肿瘤起源于干细胞，肿瘤的生长是肿瘤中极少量肿瘤干细胞增殖的结果，只有消灭这些细胞才可能彻底治愈癌症。该学说在对传统的肿瘤治疗方法提出严峻考验的同时也为我们提供了一种新的思路。对肿瘤干细胞更好的理解无疑会引导癌症的基础和临床研究、人类肿瘤的分类和新的治疗方案进入一个新时代。作者就肿瘤干细胞及肝癌干细胞的研究现状和对肝癌的治疗启示做一综述。

      关键词：肿瘤 干细胞  肝脏

 　　1 干细胞与肿瘤干细胞的概念

　　1.1 干细胞(stem cell)是一种未分化的细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化三大主要特点，根据发生学来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell)和成体干细胞(adult stem cell)。胚胎干细胞是指从受精卵发育到桑椹胚的最原始的一种干细胞，具有发育上的全能性，在理论上可诱导发育成机体中所有类型的细胞、组织或器官。成体干细胞是指存在于已分化组织中的未分化细胞，这种干细胞能自我更新并分化形成该类型组织的细胞，主要参与生理更新、修复损伤破坏的细胞以维持组织的完整性。目前发现干细胞可存在于大量组织及细胞中，如骨髓、外周血、胶质细胞、肌纤维、表皮基底层、胰岛、气管基地细胞、终末胆管细胞等[1]。

　　1.2 肿瘤干细胞概念的提出首先是基于肿瘤细胞和正常干细胞的相似性，即两者均具有无限增殖、多向分化和自我更新的能力。早在19世纪就有病理学家曾观察到肿瘤组织与胚胎组织之间有某些相似性, 由他们的观察结果人们猜想静止的胚胎干细胞可能位于成熟组织里并且在活动期这些细胞可能获得产生癌症的能力。从上世纪中后期开始研究者们进行了大量的实验研究(如对白血病、乳腺癌及脑瘤等的研究)证明肿瘤组织中并不是所有细胞都可形成转移瘤，而是其中少量的特殊细胞有这种功能，即肿瘤细胞组织具有异质性，这些特殊的细胞就是肿瘤干细胞,并且推论是肿瘤干细胞对肿瘤的增殖、转移和复发起决定性作用。Weissman等[3]提出“肿瘤干细胞学说”，认为肿瘤组织由异质性的细胞群体组成,肿瘤组织中存在的一小部分具有干细胞性质的肿瘤干细胞具有无限的自我更新能力,可以产生与上一代完全相同的子代细胞,并且具有多种分化潜能和高度增殖能力,产生不同表型的肿瘤细胞,并使肿瘤在体内不断扩大,或形成新的肿瘤。肿瘤干细胞的概念自推出以来，曾在文献中出现过的名称众多，如癌症干细胞(cancer stem cells, CSC)、致瘤细胞(tumorigenic cells)、致瘤癌细胞(tumorigenic cancer cells)、肿瘤起始细胞(tumor initiating cell,TIC)等，但目前基本以肿瘤干细胞的名称为主。

　　2 肿瘤干细胞的研究现状

　　对肿瘤干细胞的研究首先需要说明两个问题：第一，在肿瘤细胞群体中是否可以识别是哪些细胞亚群产生新的肿瘤;第二，是任何细胞还是仅正常的组织干细胞才是癌症的起源细胞，如果正常组织干细胞是引起肿瘤干细胞转化产生的主要来源，那么癌症干细胞和正常组织干细胞就可能有许多相似的特性[3]，这就涉及到肿瘤的起源问题。目前学术界对肿瘤的起源主要持三种观点：第一种观点即肿瘤干细胞学说，认为是正常干细胞发生基因突变或分化受阻形成TSC进而引起肿瘤的发生。从基因病的观点来看，一个正常细胞成为转化细胞是个逐步积累的过程，致癌性突变至少需要经历4～7次甚至更多次突变，这需要几年甚至几十年的时间，但普通分化细胞的寿命都很短，在发生多次突变之前已经凋亡。而干细胞具有无限增殖能力、寿命长、分裂慢，是发生多次突变进而转化的最好选择。绝大多数肿瘤属于上皮性肿瘤的事实也可说明这一点，容易发生肿瘤的部位如血液、胃肠道、皮肤等正是组织细胞更新频繁的部位，这些部位的干细胞容易获得多次突变而发生致癌性转化。Rubio等[4]将脂肪组织分离的基质干细胞进行长期培养，未给予任何干预的情况下最终转化为肿瘤细胞，并在小鼠体内形成肿瘤，这一定程度上证明了干细胞来源观点的正确性。第二种观点认为肿瘤细胞来源于已分化或未分化的祖细胞(progenitors)，由于癌基因突变而获得自我更新的能力。几个研究组使用 hMRP8 启动子通过转基因作用于定向祖细胞(committedprogenitors)，可产生一个髓性白血病小鼠模型，这种白血病在某些方面与人类慢性髓单核细胞白血病相似，包括单核细胞增多症、脾肿大和中性粒细胞减少，这似乎说明了该观点的正确性。最后一种观点则认为肿瘤细胞是成熟细胞去分化的结果,Goumay等[5]将大鼠成熟肝细胞标记，再给予致癌剂，数周后发现这些标记细胞表达了癌前期细胞的表面标记物，说明病灶是由成熟细胞去分化造成的。在胃癌及甲状腺癌的类似研究中亦有细胞去分化的实验证据[6，7]。尽管后两种观点都可以得到一定研究结果的支持，但肿瘤干细胞学说正得到越来越多研究成果的支持，一些新的发现还可证明所谓的组织细胞的去分化其本质很可能是肿瘤干细胞生物学特性的外在体现。

　　目前已证实有肿瘤干细胞的肿瘤主要有白血病、乳腺癌和脑瘤等部分实体瘤。早在1997年Blair等[8]已有研究证明仅有小部分白血病细胞有持续的促集落形成能力。他们证实在急性髓细胞白血病(AML)患者的样本中只有CD34+CD38-Thyl-标记的细胞具有长期增殖的能力，尽管该类细胞的数量只占细胞总数的0.2%左右，但它们却是唯一能在NOD/SCID鼠身上形成转移瘤的细胞。Bonnet[9]等也通过一系列的移植实验证明了在AML里只有一个小的白血病细胞亚群才能在小鼠体内启动白血病的发生，它们表达如CD34+/CD38-之类的干细胞标记，这些细胞被命名为SCID白血病起始细胞(SLIC)，从而明确提出了白血病干细胞(leukemia stem cells) 的概念。

　　在对畸胎瘤进行临床观察和实验研究时首次发现了实体瘤干细胞的存在，人们当时发现小鼠的畸胎瘤细胞可以发育为一个正常的小鼠个体。AlHajj等[10]从人类乳腺癌组织中分离出表达CD44+CD24-/lowESA+LIN-标记的干细胞样细胞，发现仅100个此类细胞即可在小鼠体内成瘤，而其它表型的细胞无论多少都不会成瘤。经小鼠体内传代后该型细胞自我更新及成瘤能力不变，每代均可重新形成包含干细胞和非干细胞表型的异质性细胞群体。

　　Singh等[11]证实在多种脑肿瘤如成神经管细胞瘤、低度分化的胶质瘤中存在脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell, BTSC),这些BTSC 均表达CD133分子(CD133分子又称人AC133 抗原,广泛分布在血液干细胞、前体细胞和各种上皮细胞的突出上),并且在培养液中能转化成具有临床特征表型的类似于病人体内的肿瘤细胞。Hemmati等[12]通过基因表达分析发现儿童成神经管细胞瘤细胞和胶质瘤细胞及肿瘤来源的神经球细胞(neuroapheres)可表达如CD133、Sox2、musashi21 及磷酸丝氨酸磷酸脂酶等神经干细胞和其它干细胞的基因。

　　Colins等从人前列腺癌组织中游离出表型为CD44+α2βhi1CD133+的前列腺癌干细胞。这些细胞能够分化成多种细胞类型。表达雄激素受体和前列腺酸性磷酸酶的细胞产物.表现出高度增殖潜能，在肿瘤组织中大约0.1%的细胞表现出这种表型。Hilbe 和Florek等[1314]分别报道,在非小细胞肺癌内皮祖细胞和某些型别肾肿瘤细胞上均有CD133 分子表达。随着肿瘤干细胞的不断深入研究，科学家们在其他肿瘤中也相继发现同样可能存在CSC，如皮肤癌、恶性黑色素瘤及胰腺癌[15]等，目前也有肠道干细胞和肠道肿瘤方面的研究及胃肠肿瘤干细胞方面的报道[1618]。

　　3 肿瘤干细胞与肝癌

　　和其他肿瘤一样，肝癌起源于成熟肝细胞去分化还是肝脏干细胞(hepatic stem cell，HSC)成熟受阻一直存在争议。但肝癌干细胞的观点正受到越来越多的重视。现在公认肝卵圆细胞为成年肝脏干细胞，是肝内胆管系统源性的多潜能分化细胞群，既可向胆管细胞分化，又可向肝细胞分化[19]。这些细胞主要位于胚胎肝脏或成年肝脏的胆管末端Hering管[20，21]。有文献报道肝脏干细胞与肝脏肿瘤的发生有一定关系。此外我们发现肝干细胞和肝癌细胞有许多相似的特性：(1)肝干细胞和肝癌细胞均有无限的增殖能力和分化能力，只不过前者增殖是有序的和自控性的，而后者的增殖是无序的和不受任何调控的;(2)肝干细胞和肝癌细胞都有端粒酶活性，干细胞都有端粒酶活性及扩增的端粒重复序列(而人类终末分化体细胞没有端粒酶活性)，而端粒酶活性对维持肝癌的生长和进展起重要作用[22];(3)肝干细胞和肝癌细胞都具有异质性;(4)肝干细胞和肝癌细胞可表达相同的分子标记，如甲胎蛋白(AFP)、GGP、胎盘型谷胱甘肽S 转移酶(GST—Pi)等;(5)肝干细胞和肝癌细胞的增殖均有一些相似的信号调节通路，比如Wnt、Shh、Notch、Bmi—1等 信号通路既是肿瘤生成有关的信号通路，也参与干细胞自我更新的调节。Dumble等[23]对敲除p53基因的小鼠喂缺乏胆碱而补充乙硫氨酪酸的饮食，诱导卵圆细胞大量增生，分离卵圆细胞进行培养，将有永生化特性的细胞接种人裸鼠皮下长出与肝细胞癌相似的肿瘤，检测肿瘤表面标志物，确定其由卵圆细胞分化而来，该细胞的成瘤倾向提示卵圆细胞可能参与肝癌的发生。Nakayama等[24]的实验结果提示，在肝肿瘤中可能存在肝肿瘤干细胞。国内朱海英等[25]进行了肝肿瘤干细胞方向的初步探索，将取自病人体内的新鲜肝肿瘤组织进行原代细胞培养，选取其中生长良好的肿瘤细胞开展克隆化培养与体外分化诱导，并建立了P2HCC细胞系，将此系细胞注入NODSCID小鼠体内进行荷瘤实验，表明P2HCC系细胞成瘤能力很强，但无转移能力，并且在体外可以在胰岛素/氢化可的松、二价氧砜的作用下被诱导成成熟肝细胞。经证实，此系细胞既有肝肿瘤细胞的特性，也有某些干细胞的分子标志。尽管干细胞分化受阻的假说得到不少研究人员支持，但至今尚无直观的证据证实肝癌细胞就是来源于体内原已存在的干细胞。此外，也有不少研究结果支持肝癌是肝细胞去分化的结果。

　　综上所述，肝癌很可能是一种干细胞疾病，癌组织主要由具有致癌性能的肝癌干细胞和不具有致癌性能的成熟瘤细胞组成。而这些肝癌干细胞应该就是肝癌的种子细胞(seed cells)。因此消除这些种子细胞才是治疗肝癌的根本所在。目前临床上对肝癌的治疗主要目标是尽量消除可见的肿瘤组织，而无法根除静止期的肝癌干细胞，也就没有消除肝癌的源头，因此总体治疗效果不甚理想。自从肿瘤干细胞的概念被提出以来，人们似乎看到了彻底治愈癌症的一线希望，如果癌症干细胞可以预先被识别和分离，那么将发现更多新的和有效的诊断性标志以及这些干细胞表达的治疗性靶点。肿瘤的干细胞分化受阻学说支持者认为，致癌物作用的靶点是干细胞分化成熟的微环境，各种导致该微环境结构异常和(或)化学信使传递异常的因素是致癌作用的首要原因，肿瘤的本质是起源于组织内原已存在的干细胞的分化受阻[26]。据此可以通过改善肝脏的微环境来诱导癌细胞向正常细胞分化，或者通过诱导癌细胞凋亡来达到治疗目的，而且已有相关的此类研究的报道[27]。另外已知肿瘤干细胞和正常干细胞在自我更新的调节通路上有相似性，我们可以利用两者的差别并以此为靶点进行肝癌的干预治疗，在不影响正常干细胞分化的前提下去干扰肝癌干细胞的自我更新进而使其凋亡，从而达到治疗的目的。已知的是肝癌细胞也存在Wnt、Shh、Notch通路的持续激活，过度表达EBP50蛋白持续激活Wnt通路促进肝癌的形成[28]，而Shh通路的激活有利于肿瘤生长和血管形成[29]。据此可研制针对此类通路的特异性药物来抑制肝癌干细胞的自我更新和生存，同时不影响正常干细胞。Park 等[30]报道, TGFβ能够诱导肝脏干细胞凋亡,从而抑制肝脏干细胞的过度增殖,这在肝脏损伤修复、防止干细胞突变及肝脏肿瘤的发生方面可能有重要意义。姚鹏等[31]经研究也发现, TGFβ在体外可以导致大鼠肝脏干细胞系WB2F344 的生长抑制,且呈剂量效应关系,这种抑制与诱导肝脏干细胞的凋亡有关。这些细胞因子对干细胞有明显抑制作用,但在肝脏肿瘤治疗中的作用有待进一步评估。目前在这方面已取得了一些研究进展，如治疗在急性早幼粒细胞白血病(APL)的维甲酸既是抑制APL干细胞自我更新的特效药物。

　　4 结语

　　肿瘤干细胞学说这一新概念的提出及认定无疑将会是人类攻克癌症的一大进步，将会对癌症的诊断、治疗及预防产生深远的影响，为人类治愈癌症提供重要帮助。但目前这一研究领域仅是初级阶段，还有许多问题有待解决，如是否各种肿瘤都含有肿瘤干细胞、肿瘤干细胞的具体生物学特性、肿瘤干细胞的调节机制、肿瘤干细胞的药物研制及其疫苗的研制等等，此外近年发现的SP细胞与肿瘤干细胞的具体内在联系也是需要搞清的问题之一，因为这种细胞可能与肿瘤的耐药性有很大关系[32]。总之，肿瘤干细胞的作用机制如果得到详尽阐明，那么对包括肝癌在内的所有癌症的治疗无疑将迈入一个新世纪，对肿瘤患者来说必将是一大的福音。

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