小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨

　　作者：严茂林， 王耀东， 田毅峰， 赖智德， 周松强， 邱福南 作者单位：福建省立医院 肝胆外科,福州 350001

　　【摘要】目的 探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。 方法 采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。 结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1;细胞纯度分别为(93.2±1.7)%，(90.7±1.5)%，(94.5±1.9)%。 结论 联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。

　　【关键词】 肝; 枯否细胞; 离心法,梯密度; 小鼠，近交BABLc ; 细胞分离

　　肝Kupffer细胞(Kupffer cell,KC)为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80%～90%。肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供(许可证号：046)。试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES(美国Sigma公司);兔抗人溶菌酶(lysozyme，美国DAKO公司);链霉蛋白酶E(瑞士Roche公司);RPMI1640培养基(美国Gibco公司)。超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，低温高速离心机(美国Beckman公司)。

　　1.1.3 主要液体的配制 (1)前灌注液(Hank's平衡盐溶液)。KCl 5 mmol/L,KH2PO4 1 mmol/L,NaCl 115 mmol/L,HEPES 25 mmol/L。调整pH值为7.4。(2)后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hank's平衡盐溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20%链霉蛋白酶2 mL;酶消化液：含0.20%链霉蛋白酶2 mL、0.012%DNAaseⅠ2 mL;方法2中的后灌注液含0.025%Ⅳ型胶原酶2mL。酶消化液：含0.05%IV型胶原酶2 mL;方法3中的后灌注液含0.05%Ⅳ型胶原酶1 mL、0.4%链霉蛋白酶1 mL;酶消化液：含0.10%Ⅳ型胶原酶1 mL、0.40%链霉蛋白酶1 mL、0.012%DNAaseⅠ2 mL;

　　1.1.4 SPS液的配制 100%Percoll液和8.5%NS以9∶1的比例混合，配制成SPS原液;以70%Percoll液2 mL配制：SPS 1.4 mL和PBS 0.6 mL混合配制所得;30%Percoll液的配制：PBS 1.4 mL和SPS 0.6 mL混合配制所得。

　　1.1.5 RPMI1640完全培养基的配制 按说明书配制，0.22 μm滤器过滤除菌，临用前加入10%新鲜灭活的小牛血清，青霉素100 U/mL,链霉素100 μg/mL。

　　1.2 BABL/c小鼠KC分离方法

　　1.2.1 原位肝脏灌注步骤参考文献[3]。

　　1.2.2 肝脏非实质细胞的提取及离心 将上述肝细胞滤液4 ℃离心(800 r/min×8 min)，取沉淀。加入PBS 4 mL，4 ℃离心(80 r/min×3 min)，除去沉淀，取上清。加入PBS 4 mL充分混匀，再次以4 ℃离心(150 r/min× 8 min)，取沉淀。沉淀加入PBS 2 mL,充分混匀。取10 mL离心管1支，依次加入70%Percoll、30%Percoll、细胞悬液各2 mL及少许PBS，4 ℃离心(1 600 r/min×22 min)。离心管自上而下依次为：细胞碎片、30%Percoll层、30%Percoll层与70%Percoll层之间的是大量KC及少量肝窦内皮细胞、70%Percoll层、离心管底层为少许红细胞。取30%Percoll和70%Percoll层之间的白色物，PBS 8 mL稀释细胞，4 ℃离心1次(600 r/min×8 min)，4 ℃分别离心(150 r/min×8 min)2次，除去上清。

　　1.2.3 KC贴壁培养 将上述细胞沉淀用适量10%胎牛RPMI 1640稀释，取10 μL用台盼蓝染色检测细胞活性及细胞计数，分别计算3种方法的KC得率及纯度。于37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养。4～6 h后更换培养液，去除非贴壁细胞，贴壁细胞即为试验所需的KC。分别于1，24，48 h下观察细胞形态及贴壁情况。

　　1.3 KC的鉴定

　　1.3.1 荧光显微镜观察 将KC悬液滴于细胞玻片上，328 nm激发光，荧光显微镜下观察细胞自发荧光情况。

　　1.3.2 吞噬试验 KC分别培养6，24 h后，加入50%碳素墨水2 mL 2 h后，洗涤细胞以除去未吞噬的碳素颗粒，倒置显微镜下观察细胞吞噬情况。

　　1.3.3 免疫组织化学染色 常规免疫组织化学染色，一抗为兔抗大鼠lysozyme，每次试验均设置阴性对照组，以0.01 mmol/L PBS代替一抗。

　　1.4 统计学处理 计量数据以x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件分析。组间差异用单因素方差分析，以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 荧光显微镜观察 在328 nm荧光激发下，未见KC发出荧光。

　　2.2 KC的形态变化 新鲜分离的KC呈圆形，细胞核大，细胞质少，折光性较强，远小于肝细胞，接种1 h后少部分细胞已贴壁;培养24 h后，多数细胞已伸展;培养48 h后，绝大多数细胞已贴壁，且充分伸展，可见星形或不规则形;方法3所得KC培养24 h后的细胞贴壁及形态情况(图1A)。

　　KC:肝Kupffer细胞. A：KC培养24 h后的形态(×10);B：KC培养6 h后吞噬试验(×10);C：KC培养48 h后免疫组织化学图像(×20).

　　图1 KC培养24 h后的形态、6 h后的吞噬试验、48 h后的免疫组织化学表现(略)

　　Fig 1 Morphous of KC after 24 hours culture, the phagocytosis test of KC after 6 hours culture, immunohistochemistry of KC after 48 hours culture

　　2.3 3种方法分离的KC活力、得率及纯度情况(表1)。

　　表1 3种分离方法细胞得率及细胞纯度的比较(略)

　　Tab 1 Comparison the yield and purity of KC in three separation methods

　　n=10. 与方法1比较，Δ：P<0.05;与方法2比较，#：P<0.05;与方法1比较，☆：P<0.05.

　　2.4 吞噬试验 KC分别培养6 h，再与碳素墨水颗粒培养2 h，可见KC内吞噬大量碳素墨水颗粒(图1B)。

　　2.5 免疫组织化学染色 KC培养48 h后，免疫组织化学染色显示细胞内溶菌酶96%以上为阳性染色，细胞内呈棕黄色(图1C)，证实所分离贴壁细胞为KC。

　　3 讨论

　　目前分离肝脏非实质细胞的方法主要有密度梯度离心法、离心淘析法及将两者相结合的方法。Valatas等先用密度梯度法将死亡的肝细胞与肝非实质细胞分离，然后利用离心淘析法分离大鼠KC，进一步利用选择性贴壁纯化KC，获得较好的细胞得率和纯度[4]。由于离心淘析法设备昂贵，难以在一般试验室推广。本实验利用联合酶在体和离体灌注、密度梯度离心和选择性贴壁法，具有以下优点：(1)Ⅳ型胶原酶和链霉蛋白酶的用量少。以相同体质量的肝组织计算，Ⅳ型胶原酶的使用量仅仅相当于Jiang等用量的1/50[2];(2)细胞得率、纯度相对较高。本实验注重在体灌注和酶的联合应用，提高酶的效率;(3)灌注时间较短，污染机会较少;(4)操作方便，无需特殊设备。与其他方法相比较[3,57]，本实验方法同样取得与其相当的细胞得率和纯度，且节省分离时间和酶用量。

　　本实验系统地比较了3种不同分离方法的KC细胞纯度和得率，结果显示，联合链霉蛋白酶与Ⅳ型胶原酶在体灌注和体外消化所获得的KC纯度和得率均较为理想。方法3同时使用了3种酶，其中链霉蛋白酶裂解肝细胞，Ⅳ型胶原酶解除肝非实质细胞间的连接，DNA酶降解DNA，从而形成较为完全的单细胞悬液，比其他2种方法获得较高的细胞得率。方法2由于没有使用链霉蛋白酶，肝细胞破坏较少，形成的单细胞悬液较为不完全，所以细胞纯度及细胞得率较低。方法1使用了链霉蛋白酶和DNA酶，减少了絮状物的形成，相对方法2所获得的细胞得率较高。

　　门静脉插管是完成在体灌注的关键。首先使门静脉保持一定张力，从肠系膜上静脉处沿门静脉方向呈15°进针，使针尖超过脾静脉入口，然后用血管夹夹闭以阻断入肝血流。同时灌注时应排尽针管空气，防止血管空气栓塞导致肝组织消化不良。另外笔者术中采用血管夹以固定头皮针，防止针管移动和滑脱，同时防止灌注液的流失和停止灌注时肠系膜上静脉及脾静脉的血液回流，是在体灌注顺利完成的关键。

　　笔者认为KC得率影响因素主要有以下几点：(1)门静脉灌注良好与否是影响肝KC得率的关键，这与其它学者报道一致[3];(2)消化不完全时，难以获得完全的单细胞悬液，含有KC的组织被滤网滤除或离心时丢失，细胞不纯会进一步影响KC贴壁。联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶离体消化能获得较为完全的单细胞悬液[8];(3)用链霉蛋白酶E消化后，细胞悬液中很快出现絮状物。絮状物中会网络较多KC，影响离心过程中KC的分离。加用DNA酶Ⅰ能有效防止絮状物的形成，提高细胞得率;(4)在贴壁时间相同的情况下，KC的纯度和数量是相互矛盾的。

　　【参考文献】

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