塞来昔布对胆管癌细胞株QBC939 VEGF表达的影响

　　作者：潘润阳 作者单位：福建医科大学附属第一医院外科, 福州 350005

　　【摘要】 目的 探讨环氧合酶2(COX2)抑制剂塞来昔布对胆管癌细胞株QBC939血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。 方法 体外培养胆管癌细胞株QBC939，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测塞来昔布与胆管癌细胞株QBC939 VEGF表达间的时效关系和量效关系。 结果 塞来昔布在一定剂量(20～80 μmol/L)和时间(12～48 h)内显著抑制QBC939细胞VEGF mRNA的表达和培养上清液中VEGF的浓度，与单独培养液对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05)。 结论 选择性COX2抑制剂塞来昔布可在一定时间和剂量范围抑制胆管癌细胞株QBC939 VEGF的表达。

　　【关键词】 胆管癌 环氧合酶 COX2抑制剂 VEGF 塞来昔布

　　Effects of Cyclooxygenase2 Inhibitor Celecoxib on the Expression of VEGF in Human Cholangiocarcinoma QBC939 Cell Lines

　　PAN Runyang， SHI Zheng， HE Qingliang

　　Department of General Surgery, The Affiliated First Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effects of the selective cyclooxygenase2(COX2) inhibitor, celecoxib, on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in human cholangiocarcinoma QBC939 cell lines. Methods The relationship between celecoxib and the expression of VEGF in human cholangiocarcinoma QBC939 cell lines were studied by using reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR) and enzymelinked immunoadsorbent assay(ELISA). Results The expression of VEGF were inhibited significantly in a timedependent(12～48h) and dosedependent(20～80 μmol/L)manner than the control group(P<0.05). Conclusion The selective COX2 inhibitor, celecoxib may play an important role on the inhibition of VEGF expression in human cholangiocarcinoma QBC939 cell lines.

　　KEY WORDS: cholangiocarcinoma; cyclooxygenase2; cyclooxygenase2 inhibitor; vascular endothelial growth factor; celecoxib

　　福建医科大学学报 2008年7月 第42卷第4期潘润阳等：塞来昔布对胆管癌细胞株QBC939 VEGF表达的影响胆管癌是胆道常见恶性肿瘤，早期临床症状不典型，易向周围组织、血管和神经浸润。多项研究证实，环氧合酶2(cyclooxygenase2，COX2)不仅与炎症反应过程密切相关，而且对多种肿瘤的发生、发展和预后都起着重要的作用[12]，其机制目前尚未明确，可能与肿瘤细胞的增殖和凋亡调节的紊乱，血管生成以及肿瘤细胞的黏附、浸润等多个环节有关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前所知最强的促进血管内皮生长的细胞因子。笔者研究选择性COX2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)与胆管癌细胞株QBC939 VEGF表达的关系，探讨COX2对胆管癌血管生成的作用机制，为塞来昔布在胆管癌防治的临床研究提供实验参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人胆管癌QBC939细胞株由第三军医大学西南医院董家鸿教授惠赠。0.25%胰蛋白酶、RPMI1640培养基、小牛血清(美国Gibco公司)，塞来昔布(合肥森瑞化工有限公司)，OneStep RTPCR 试剂盒(美国Promega公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，引物和DNA marker(厦门泰京生物技术有限公司)，人VEGF ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　细胞用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素链霉素的RPMI1640培养基，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，细胞换液时间1～2 d，传代2～4 d，传代前用0.25%胰蛋白酶消化。

　　1.2.2 一步法半定量RTPCR

　　1.2.2.1 总RNA提取

　　QBC939细胞以5×105mL1接种于6孔细胞培养板，待长满80%，一组细胞加入40 μmol/L 塞来昔布分别作用0，12，24，36，48 h,另一组细胞以不同浓度塞来昔布(0，10，20，40，80 μmol/L)作用24 h。收集细胞，按Trizol说明书一步法提取细胞总RNA，并进行纯度分析、定量及琼脂糖凝胶电泳观察，D260 nm/D280 nm为1.8～2.0。

　　1.2.2.2 RTPCR VEGF引物

　　上游: 5’ATGAACTTTCTGCTGTCTTG3’

　　下游: 5’TGCATGGTGATGTTGGAC3’

　　扩增后DNA片段长382 bp。

　　GAPDH引物

　　上游: 5GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA3’

　　下游: 5’TGTTAGTGGGTCTCGCTCCTG3’

　　扩增后DNA片段长223 bp。

　　用OneStep RTPCR试剂盒检测，结果用凝胶图像软件Gel pro4.0(Media Cybernetics)分析，VEGF/GAPDH比值反映VEGF mRNA的相对含量。一式3份,重复3次。

　　1.2.3 ELISA检测细胞上清液VEGF浓度

　　QBC939细胞以5×105mL-1接种于24孔细胞培养板，待长满80%，加入塞来昔布，分组同上。吸取培养上清,用双抗体夹心ELISA法检测VEGF含量,操作方法按说明书进行。一式3份,重复3次。

　　1.3 统计学处理

　　测定结果数据以x±s表示,采用SPSS 10.0统计软件进行分析,组间差异以单因素方差分析进行检验,P<0.05为差别具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 塞来昔布对胆管癌细胞株QBC939 VEGF mRNA表达的影响

　　在一定浓度及时间内随着塞来昔布浓度递增或作用时间延长，QBC939细胞VEGF mRNA表达递减(图1A，2A)。对凝胶成像分析系统分析得出VEGF和GAPDH的比值进行的统计分析结果见图1B,2B。

　　2.2 塞来昔布对胆管癌细胞株QBC939 分泌VEGF的影响

　　塞来昔布的浓度为20,40及80 μmol/L时，明显抑制VEGF的分泌(与对照组比较分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01)(图3)。40 μmol/L 塞来昔布作用12,24,36及48 h后可显著降低培养上清液中VEGF浓度(与对照组比，P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01)(图4)。

　　3 讨 论

　　3.1 COX2及VEGF的生物学功能

　　研究表明，胆管癌组织存在着COX2及VEGF的表达，两者显著相关[34]。COX是前列腺素合成的限速酶，已知有2种亚型：环氧化酶1(COX1)和环氧化酶2(COX2)。COX2是一种诱导酶，在正常组织中低表达，一般难以检测，当细胞接受肿瘤坏死因子、白细胞介素1、表皮生长因子及各种促癌因素刺激便开始合成表达。VEGF是目前所知最强的促进血管内皮生长的细胞因子，能选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种酪氨酸激酶受体而发挥作用。血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移过程中的重要环节，实体肿瘤的进行性生长及转移有赖于其新生血管的形成[5]。VEGF常在多种肿瘤中过表达，可作为肿瘤病人无瘤生存率的观测预后指标[6]。VEGF的高度表达与肿瘤的转移、复发及预后密切相关，减少肿瘤细胞的VEGF的表达可望延缓肿瘤的发展与扩散。

　　3.2 塞来昔布对QBC939 VEGF表达的影响

　　本实验在基因和蛋白水平探讨选择性COX2抑制剂塞来昔布与胆管癌细胞株QBC939 VEGF表达的量效和时效关系。结果显示，无论是RTPCR检测VEGF mRNA的表达，还是ELISA检测细胞上清液中VEGF蛋白的分泌，塞来昔布与VEGF之间都存在一定的剂量和时间上的依赖性关系，表现为在一定范围的实验浓度及时间内，随着塞来昔布浓度增高及作用时间延长，VEGF表达量递减，提示塞来昔布对胆管癌细胞VEGF的表达具有抑制作用。

　　3.3 塞来昔布对VEGF表达抑制作用的机制

　　COX2抑制剂可降低肿瘤的发生率并预防肿瘤的形成[7]。其作用靶点为环氧合酶，其经COX2途径抑制肿瘤发生的可能机制有：减弱bFGF、VEGF和PDGF的表达抑制血管的发生;通过降低bcl2和Akt酶活性促进凋亡;抑制DNA的氧化和突变[8]。UefujiK等认为COX2可能产生前列腺素E2(PGE2)，通过EP受体/cAMP途径来调节肿瘤中VEGF基因转录表达[9]。

　　Abdelrahim等用基因敲除方法研究认为，COX2抑制剂之所以能降低VEGF的表达抗血管生成，在于VEGF启动子结合sp蛋白的位点，与依赖性的Spl、Sp4蛋白质的降解有关[6]。新近研究认为，COX2抑制剂抗肿瘤作用尚存在非COX2依赖途径，即不通过下调COX2的水平，其作用机制可能与塞来昔布抑制IKKβ活性、NFκB与DNA结合能力有关[910]。

　　选择性COX2抑制剂塞来昔布是近年开发的新型非甾体类抗炎药，在抑制胆管癌发生、发展过程中起着一定的作用。除了已知的诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖外，本研究还提示其在抑制肿瘤微血管的生成有一定的作用,此为胆管癌的抗血管治疗提供一定的实验参考。本课题组已证实反义RhoC可抑制QBC939细胞的增殖[11]，选择性COX2抑制剂与RhoC抑制剂的联合应用是否更有效抑制胆管癌的增殖，有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Zha S, Yegnasubramanian V, Nelson W G, et al. cyclooxygenase in cancer：progress and perspective[J]. Cancer Lett, 2004,215(1):120.

　　[2] Cressey R, Pimpa S, Tontrong W, et al. Expression of cyclooxygenase2 in colorectal adenocarcinoma is associated with p53 accumulation and hdm2 overexpression[J]. Cancer Lett, 2006,233(2):232239.

　　[3] Tamura M, Sebastian S, Gurates B, et al. Vascular endothelial growth factor upregulates cyclooxygenase2 expression human endothelial cells[J]. Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(7):35043507.

　　[4] Joo Y E, Rew J S, Seo Y H, et al. Cyclooxygenase2 overexpression correlates with vascular endothelial growth factor expression and tumor angiogenesis in gastric cancer[J]. J Clin Gastroenterol, 2003,37(1):2833.

　　[5] 寿成超. 抗血管生成和肿瘤生物治疗[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2006,13(6):401403.

　　[6] Abdelrahim M, Safe S. Cyclooxygenase2 inhibitors decrease vascular endothelial growth factor expression in colon cancer cells by enhanced degradation of Sp1 and Sp4 proteins[J]. Mol Pharmacol , 2005,68(2):317329.

　　[7] Yu J, Tang B D, Leung W K. Different cell kinetic changes in rat stomach cancer after treatment with Celecoxib or indomethacin：implications on chemoprevention[J]. World J Gastroenterol, 2005,11(1):4145.

　　[8] Chu A J, Chou T H, Chen B D. Prevention of colorectal cancer using COX2 inhibitors: basic science and clinical applications[J]. Front Biosci, 2004,9:26972713.

　　[9] Uefuji K, Ichikura T, Mochizuki H. Cyclooxygenase2 expression is related to prostaglandin biosynthesis and angiogenesis in human gastric cancer [J]. Clin Cancer Res, 2000,6(1):135138.