拉米夫定联合疗肝3号对乙型肝炎病毒YMDD变异的影响及机制分析

　　作者：涂燕云，张红星，陈枝俏，蒋阳昆，林海 作者单位：广西中医学院附属瑞康医院肝胆内科，广西，南宁，530011

　　【摘要】 目的 观察拉米夫定联合疗肝3号对乙型肝炎病毒YMDD变异的影响。方法 将80例慢性乙型肝炎(CHB)患者随机分为治疗组和对照组，治疗组40例为联合应用拉米夫定和疗肝3号;对照组40例为单用拉米夫定，疗程均为18个月，每3个月分别检测肝功能、乙型肝炎病毒血清学标志物、HBV DNA、YMDD变异株、T淋巴细胞亚群。结果 在治疗12个月时，治疗组出现2例(5.00%)变异，对照组5例(12.50%)，差异无显著性(P>0.05);在治疗18个月时，治疗组出现4例(10.00%)变异，对照组12例(30.00%)，差异有显著性(P<0.05)。停药6个月后治疗组在HBV-DNA阴转、HBeAg/抗-HBe血清转换、HBeAg阴转上明显优于对照组(P均<0.05)。治疗组外周血CD4+亚群水平上调，CD4+/CD8+比值趋于正常，停药6个月后仍持续保持高水平，与对照组比较差异有高度显著性(P均<0.01)。结论 拉米夫定联合疗肝3号有调节CHB患者细胞免疫水平的作用，可减少YMDD变异的发生。

　　【关键词】 肝炎 乙型 慢性 基因变异 拉米夫定 疗肝3号

　　Lamivudine in combination with Liaogansanhao in treatment of patients with chronic hepatitis B and its effects on YMDD variants

　　TU Yan-yun, ZHANG Hong-xing, CHEN Zhi-qiao, JIANG Yang-kun, LIN Hai

　　(Internal Hepatobiliary Department, Affiliated Ruikang Hospital to Guangxi TCM University, Nanning, Guangxi 530011, China)

　　Abstract: Objective To observe the effects of traditional Chinese medicine Liaogansanhao in combination with lamivudine in treatment of patients with chronic hepatitis B (CHB) and its effects on YMDD variants. Methods 80 patients were enrolled and randomized into two groups: the treated group of 40 cases, treated with Liaogansanhao in combination with lamivudine; the control group of 40 cases, treated with lamivudine alone. One cycle lasted for 18 months, every 3 months, the liver function, virological markers of HBV, serum HBV DNA, YMDD variants and T-cell subpopulation were determined. Results At the end of 12-month treatment, 2 cases (5.00%) in the treated group and 5 cases (12.50%) in the control group with YMDD variants were observed, there was no statistical difference (P<0.05). At the end of 18-month treatment, 4 cases (10.00%) with YMDD variants were observed in the treated grup and was significantly less than the control group, 12 cases (30.00%), P<0.05. Six months after treatment, HBV-DNA-negative rate, HbeAg/anti-HBe negative and HBeAg negative rate in the treated group were superior to the control group (all P<0.01). In the treated group, the CD4+ level was up-regulated and the ratio of CD4+/CD8+ tended to be in a normal level, and 6 months after the treatment the level remained in a high level, and was significantly higher than the control group (all P<0.01). Conclusion Liaogansanhao in combination with lamivudine may up-regulate the cell immunological level in patients with CHB, which may reduce the occurrence of YMDD.

　　Key words: hepatitis B, chronic; gene variants; lamivudine; Liaogansanhao

　　拉米夫定在慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治疗上的广泛应用，是近年来CHB治疗的重大进展，已成为CHB的基础用药，但每年约有15%的患者出现HBV P基因YMDD变异，成为临床医生目前最为棘手的问题。如何预防拉米夫定抗病毒治疗中出现的YMDD变异已经是当前临床医生最想解决的问题。我们在临床的治疗中发现通过中药调整机体免疫功能来治疗CHB在临床上也有一定的疗效，且对拉米夫定抗病毒治疗中出现的YMDD变异有延缓和减少其发生的作用。笔者自2004年8月～2007年8月采用中西医结合的方法，应用拉米夫定联合疗肝3号治疗CHB，以观察其对YMDD变异的影响。现报道如下：

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　80例患者均为我院肝胆内科门诊或住院患者，西医诊断符合2000年病毒性肝炎诊断标准[1]。病例符合以下条件：①HBsAg阳性，HBeAg阳性或阴性，HBV DNA阳性;②2u<谷丙转氨酶(ALT)<10u;③YMDD变异株阴性;④总胆红素<85.5μmol/L;中医辨证属肝胆湿热证，诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》(2002版)[2]：身目黄染、胁痛、腹胀、胸闷、烦热、口干而苦、食欲不振、恶心呕吐、乏力、小便黄赤、大便秘结或稀溏、舌红、苔黄腻、脉弦滑数。全部病例随机分为两组，每组40例。治疗组男25例，女15例，年龄(27.83±6.30)岁，病程(4.24±3.72)年;对照组男27例，女13例，年龄(26.65±5.38)岁，病程(3.89±3.10)年。两组患者基本情况比较差异无显著性(P>0.05)，具有可比性。

　　1.2 纳入标准

　　①符合西医诊断标准及中医肝胆湿热证诊断标准者;②年龄在16～65岁范围内，能配合检查及愿意服食中药治疗者。

　　1.3 排除标准

　　①年龄<16岁或>65岁者;②凡不符合纳入标准者;③孕妇和哺乳期妇女;④伴有失代偿性肝硬化者;⑤肾功能不全者或合并心血管、脑、血液系统等严重并发症者;⑥有糖尿病史、吸毒及酗酒史者;⑦合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV重叠感染者;⑧精神病患者;⑨半年内使用过抗病毒药及免疫调节剂、糖皮质激素者;⑩不愿意服中药治疗或不能配合检查或未按规定服药者。

　　1.4 治疗方法

　　治疗组：疗肝3号主要成分为黄芪、紫河车、天星草、田基黄、白花蛇舌草、垂盆草、郁金、丹参等，由笔者提供处方，本院制剂室研制，每次4粒，每日3次口服，同时联用拉米夫定片剂(葛兰素史克中国投资有限公司生产，100mg/片)每次100mg，每天1次，早晨空腹口服，疗程18个月。对照组：单服拉米夫定片剂，剂量、疗程同治疗组。所有观察病例不加用降酶、退黄及其他抗病毒或免疫调节药物。

　　1.5 观察指标

　　1.5.1 中医证候及舌脉变化

　　包括胁痛、腹胀、纳呆、乏力、恶心、二便、舌苔、脉象等。每15天记录1次。

　　1.5.2 HBV标志

　　采用ELISA法，检测仪器为郑州博赛酶标仪，试剂由英科新创(厦门)科技有限公司生产。每3个月测1次。

　　1.5.3 HBV DNA

　　采用荧光定量PCR法，仪器为美国ABI Prisa 7000型基因扩增仪，试剂由深圳匹基生物工程股份有限公司提供，以<103copies/ml定为阴性。每3个月测1次。

　　1.5.4 肝功能

　　采用比色法，检测仪器为美国杜邦德林公司Dimension 全自动生化分析仪，试剂为配套DADE BEARING BC4148。每3个月测1次。

　　1.5.5 HBV YMDD变异株

　　采用PCR体外扩增结合杂交探针荧光检测方法于治疗前，治疗第6、9、12、18个月各检测1次。

　　1.5.6 T淋巴细胞亚群

　　流式细胞仪和免疫荧光标记试剂均为美国BD公司产品，分离外周血单核细胞(PBMC)，取患者静脉血5ml，肝素抗凝，按常规方法用淋巴细胞分层液分离PBMC，用Hank液洗涤3次，将PBMC浓度调整到1×109个/L，测定T淋巴细胞亚群按说明书操作。收集1000个淋巴细胞的光散射及荧光数据，用计算机分析测定结果。治疗前，治疗第6、9、12、18个月，停药后6个月各检测1次。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS 11.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。其中，HBV DNA定量结果进行对数转换。

　　2 结果

　　2.1 两组ALT变化情况

　　见表1。表1 两组治疗前后ALT变化比较(略)

　　2.2 两组乙型肝炎病毒学指标变化情况

　　见表2。表2 两组治疗结束时乙型肝炎病毒学指标比较 (略)

　　2.3 两组T淋巴细胞亚群的变化情况

　　见表3。表3 两组患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群变化比较(略)

　　2.4 两组YMDD变异情况

　　见表4。表4 两组YMDD变异情况比较(略)

　　3 讨论

　　CHB发病机制十分复杂，目前认为宿主免疫功能紊乱是其病理损伤的主要原因，其中乙肝免疫异常与细胞因子有关，并且在清除HBV及免疫损伤中起着重要作用。T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群，在正常机体内各T淋巴细胞亚群相互作用，维持着机体正常的免疫功能，T细胞免疫功能之强弱与CHB临床过程之轻重有密切关系。

　　近年来人类T淋巴细胞亚群的研究有了飞速发展，现一般将人类外周T淋巴细胞分为CD4+与CD8+两个亚群，CD4+代表辅助性T淋巴细胞，CD8+代表抑制性T淋巴细胞，CD4+和CD8+维持平衡稳定关系，相互协同、相互抑制，以维持体内抗病毒免疫的正常。慢性肝炎患者常存在细胞免疫功能紊乱，表现为外周血T淋巴细胞亚群指标CD4+显著下降，CD8+显著升高，CD4+/CD8+比值显著降低。故本研究将T淋巴细胞亚群作为主要观察指标，以了解疗肝3号对患者的细胞免疫功能状况的影响。

　　中医基本理论认为“正气存内，邪不可干”，“邪之所凑，其气必虚”，正气反映人体的免疫功能。中医重点在于调整人体的功能状态，发挥抗病的能力，这与现代药理学有显著的不同。我们认为正气来源于先天，依赖后天充养，与脾肾关系密切。根据这些理论，拟定补肾健脾益气的中药来激活免疫功能，打破免疫耐受，达到内源性清除病毒的目的。方中黄芪补脾益气，紫河车补肾益精、益气养血，两者同为君药;天星草、田基黄、白花蛇舌草、垂盆草，清热利湿解毒，共为臣药;郁金具有辛开苦降之性，芳香宣达，性寒，能清热，入气分能行气解郁，入血分能凉血散结，为血中之气药，丹参活血祛瘀，两药相伍共奏行气活血凉血之功，同为佐药;甘草调和、引药为使。现代药理学研究表明：黄芪能促进肝细胞再生和肝脏蛋白质更新，并能调节免疫，诱生干扰素[3]。紫河车具有调节体液免疫、抗病毒等作用[4]。

　　本研究结果提示，疗肝3号的作用机制与拉米夫定有所不同，后者主要抑制病毒逆转录酶活性而阻断复制，对人体的免疫功能无影响，其抑制病毒复制的初始反应较迅速，HBV DNA水平很快下降。而前者不在于直接抗病毒，作用靶点主要影响人体的免疫功能。本组T淋巴细胞亚群分析结果表明，联合治疗后，患者外周血CD4+淋巴细胞亚群上调，CD8+亚群下调，二者比值趋于正常，并且这种激活免疫反应的作用时间相对较长，持续到停药半年后仍保持高水平。在本课题的研究过程中发现治疗组在治疗1个月后部分病人ALT较原来稍有升高，至第6个月达到高峰，随后逐渐下降，直至恢复正常水平。有人认为[5]，CHB出现ALT升高，常导致血清HBeAg阳性向阴性转化，甚至可出现病毒被完全清除，推测其发生机制可能与体内细胞免疫被激活有关。中医理论认为，正邪相争存在于CHB的全过程，肝功能损害是正邪相争的结果，正虚邪恋相持不下则乙肝病毒久稽不除，此时应扶持正气，打破这种相持状态，达到正复邪退。

　　研究表明，拉米夫定与疗肝3号联合治疗组与单用拉米夫定组在治疗结束时比较，在HBV-DNA阴转、HBeAg/抗-HBe血清转换方面疗效相近，但在HBeAg阴转上，治疗组达到36.67%，显著高于对照组(12.50%)。停药6个月随访发现治疗组在HBV-DNA阴转、HBeAg/抗-HBe血清转换、HBeAg阴转上明显优于对照组(P均<0.05)。在YMDD变异方面，两组患者治疗前均未发现YMDD变异;治疗12个月时，治疗组共有2例(5.00%)检测出YMDD变异，对照组为5例(12.50%)，但差异无显著性(P>0.05);治疗18个月时，治疗组共有4例(10.00%)检测出YMDD变异，对照组为12例(30.00%)，两者差异有显著性(P<0.05)。推测其机理为疗肝3号能够上调CD4+细胞、CD4+/CD8+比值水平，具有正向免疫调节作用，在治疗进程中激活体内免疫系统，并且这种作用在停药后仍有延迟效应，持续较长时间，且维持在高水平，使病毒始终处于不断清除中，从而防止了反跳，减少了YMDD变异的发生，值得临床进一步推广。

　　【参考文献】

　　[1]医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志，2000，8(6)：324-329.

　　[2]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则[M].北京：中国医药科技出版社，2002：171-174.

　　[3]阴健，郭力弓.中药现代研究与临床应用[M].北京：学苑出版社，1993:486，598.

　　[4]李际强，张奉学，符林春.紫河车中抗病毒活性成分分离、克隆的设想[J].广州中医药大学学报，2000，17(4)：296-300.

　　[5]杨倩.白介素-12在慢性乙肝感染者血清和外周血单核细胞中的表达[J].中华肝脏病杂志，2003，11(2)：40.