反义血管内皮生长因子(VEGF)转染体内抑制胆囊癌VEGF及其受体表达的研究
发表时间：2010-10-13 浏览次数：294次
作者：李海军， 庞作良， 毛拉艾沙·买买提， 孙晓宏， 王晓文 作者单位：新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科, 新疆乌鲁木齐830011
【摘要】 目的: 探讨Oligofectamine介导的血管内皮生长因子(VEGF) 反义寡核苷酸(ASODN)转染对人胆囊癌GBCSD细胞裸鼠移植瘤的生长及VEGF、Flt1和KDR表达的影响。方法：通过裸鼠皮下接种体外培养的人胆囊癌GBCSD细胞建立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型，并将裸鼠分为对照组(A组)、VEGF SODN+Oligifectamine组(B组)和VEGF ASODN+Oligifectamine组(C组)，各组裸鼠在接种后24 h内，在接种部位皮下分别缓慢注射200 μl磷酸缓冲液(PBS)、VEGF SODN 100 μg+Oligofectamine 0.5 μl (总体积为200 μl)及VEGF ASODN 100 μg+Oligofectamine 0.5 μl(总体积为200 μl)，每3天 1次，连续治疗5周，观察各组裸鼠的成瘤性、体积及瘤重的变化，并运用免疫组化技术检测胆囊癌裸鼠移植瘤中VEGF、Flt1和KDR的表达变化。结果：A、B、C组裸鼠2周时的成瘤率分别为87.5%、87.5%和37.5%，C组显著低于A、B组(P<0.05)，5周时各组的成瘤率均为100%。各组裸鼠移植瘤5周时的体积和瘤重分别为：A组(253.49±27.11) mm3和(1.96±0.17) g，B组(255.84±26.51) mm3和(1.86±0.21) g，C组(125.45±17.49) mm3和(0.97±0.13) g，C组显著低于A、B组(P<0.05)，C组的抑瘤率为(50.79±9.19)%。A、B组裸鼠移植瘤VEGF、Flt1和KDR的表达均无统计学差异(P>0.05), 而C组裸鼠移植瘤VEGF、Flt1和KDR的表达较A、B组明显减弱(P<0.05)。结论： VEGF ASODN在体内能显著抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤的增殖, 降低其在裸鼠体内的成瘤性，抑制VEGF、Flt1和KDR在蛋白水平的表达，抑制裸鼠移植瘤的生长及血管的形成。
【关键词】 血管内皮生长因子(VEGF); 反义寡核苷酸(ASODN); Flt1; KDR
The effect of of oligofectamine mediated VEGF ASODN transfection on the growth, VEGF, Flt1 and KDR protein expression of GBCSD cells transplant tumor of nude mice in vivo
LI Haijun, PANG Zuoliang, Maolaaisha·Maimaiti, et al
(Department of Hepatobiliopancreatic Surgery, Affilicated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
Abstract: Objective: To investigate the effect of of oligofectamine mediated VEGF SODN transfection on the growth, VEGF, Flt1 and KDR protein expression of GBCSD cells transplant tumor of nude mice in vivo. Methods: GBCSD cells were injected subcutaneously into nude mice to establish successfully transplant tumor model of gallbladder carcinoma. All mice were divided randomly into A group (control), B group(VEGF SODN+Oligifectamine) and C group(VEGF ASODN+Oligifectamine). The mice of A, B and C group were injected 200 μl PBS, VEGF SODN 100 μg+Oligofectamine 0.5 μl (volume 200 μl) and VEGF ASODN 100 μg+Oligofectamine 0.5 μl (total volume 200 μl) into the spot of GBCSD cells inocμlation in 24 h respectively. The therapy was done one time every 3 days and last 5 weeks continuously. The incidence, weight and volume of transplant tumor of all mice were observed and measured, meantime, the VEGF, Flt1 and KDR protein expression were tested by immunohistochemistry. Results: The incidences of transplant tumor in mice of group A, B and C were 87.5%, 87.5% and 37.5% respectively in 2 weeks. The difference was significant in mice of group C as compared to that of group A and B (P<0.05). The incidences of transplant tumor in mice of group A, B and C were all 100% in 5 weeks. The volume and weight of transplant tumors of group A, B and C were (253.49±27.11) mm3 and (1.96±0.17) g， (255.84±26.51)mm3 and (1.86±0.21)g，(125.45±17.49)mm3 and (0.97±0.13)g respectively， which was significantly different in group C as compared to that of group A and B as well (P<0.05). The VEGF, Flt1 and KDR protein expression of transplant tumor had not any difference between group A and B (P>0.05), but as for group C, the VEGF, Flt1 and KDR protein expression were significantly inhibited as compared to those of group A and B (P<0.05). Conclusion: VEGF ASODN could significantly inhibit proliferation and incidence of transplant gallbladder carcinoma, inhibit the VEGF, Flt1 and KDR protein expression of transplant tumor.
Key words: VEGF; ASODN; Flt1; KDR
近年对胆囊癌的研究证实，肿瘤血管生成是胆囊癌产生、发展和转移过程中的关键步骤。研究发现，VEGF、Flt1和KDR在胆囊癌组织中存在过度表达，血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)在体外能显著抑制GBCSD细胞VEGF、Flt1和KDR的表达，抑制GBCSD细胞增殖。为观察VEGF ASODN转染后对GBCSD细胞增殖及血管生成的体内疗效，本实验通过裸鼠皮下接种体外培养的VEGF ASODN转染后的GBCSD细胞建立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型，旨在探讨VEGF ASODN对胆囊癌裸鼠移植瘤的成瘤性、肿瘤VEGF、Flt1和KDR的表达变化的作用。
1材料与方法
1.1材料人胆囊癌细胞株GBCSD购自中科院上海细胞生物学研究所。RPMI1640培养基(含双抗)，0.25%胰蛋白酶(含EDTA)购自Gibco公司。 小牛血清购自杭州四季青公司。
OligofectamineTM Reagent(20 μM)购自Invitrogen公司。VEGF反义寡核苷酸、VEGF错义寡核苷酸和VEGF、Flt1、KDR与βactin引物均由上海生工生物工程公司合成。链霉素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化染色(SP)法超敏试剂盒和鼠抗人VEGF 单克隆抗体、鼠抗人Flt1单克隆抗体、鼠抗人Flk1/KDR单克隆抗体均为Santa Crus Biotechnology,Inc产品，购自北京中山生物技术有限公司。4周龄SPF级BALB/c, nu/nu裸鼠24只，体重20~25 g，雌雄不分，购自浙江大学医学院实验动物中心，并在其SPF环境下饲养。
1.2方法
1.2.1细胞培养及寡核苷酸合成将人胆囊癌GBCSD细胞贴壁培养于含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，37℃，5%饱和湿度CO2培养箱中培养, 细胞长满瓶底70%～80%时采用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混和液消化传代，2～3 d传代1次,传代后48 h处于指数生长期的细胞备实验用。实验用细胞经0.4%台盼蓝染色，拒染率>95%。VEGF反义寡核苷酸及错义寡核苷酸序列参照文献[1], VEGF反义寡核苷酸(ASODN)序列为: 5TGGCTTGAAGATGTACTCGAT3，VEGF错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide SODN)序列为：5TACGTAGTATGGTGTACGATC3, 由上海生工生物工程有限公司合成,全硫代修饰,保存于-70℃待用。
1.2.2肿瘤细胞悬液的制备取对数生长期的GBCSD细胞，接种于250 ml 细胞培养瓶至其生长至80%～90% 融合,消化后离心, 以不含血清的培养液洗涤2次,0.5%台盼蓝染色计数(活细胞数>95%),计数活细胞数,调整细胞浓度为1×107/ml,最终将细胞悬浮于无血清的培养液中备用。
1.2.3胆囊癌裸鼠移植瘤模型的制作裸鼠称重后按随机数字分成3组：对照组 (A组)、VEGF SODN+Oligifectamine组(B组)及VEGF ASODN+Oligifectamine 组(C组)，每组8只。取配置好的GBCSD细胞悬液，以0.2 ml接种于每只裸鼠背部皮下，以皮下结节直径超过0.5 cm为成瘤标准。接种后继续饲养于恒温(25±2)℃、恒湿(45～50)%、无菌净化屏障系统内SPF环境下自由摄食。
1.2.4抑制成瘤试验(1)C组在接种胆囊癌细胞GBCSD 24 h内，每只裸鼠接种部位皮下缓慢注射VEGF ASODN 100 μg+Oligofectamine 0.5 μl (总体积为200 μl)，每3天1次，连续治疗5周。(2)B组：同法注射VEGF SODN 100 μg+Oligofectamine 0.5 μl, 每3天1次，连续5周。A组裸鼠则给予同法注射等量的PBS液。接种肿瘤细胞后将裸鼠置于SPF饲养条件下饲养，定期观察裸鼠, 约3周后裸鼠成瘤, 于治疗5周后处死裸鼠，拍照, 解剖出瘤体，称重，并测量肿瘤长轴(a)、短轴(b)，根据公式V=1/2ab2计算肿瘤体积。肿瘤生长抑制率计算公式为：抑制率=(对照组瘤重-治疗组瘤重)/对照组瘤重×100%。
1.2.5胆囊癌裸鼠移植瘤VEGF、Flt1和KDR的免疫组化检测免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行，PBS代替Ⅰ抗作阴性对照。VEGF、Flt1和KDR蛋白免疫组织化阳性表达定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒。在光学显微镜下观察全片，对切片染色阳性情况进行评估，结果判定参照文献[2]进行。随机选取5个高倍视野，根据阳性细胞数量、百分率，表达强度分为4级：0级为无明显阳性反应细胞;Ⅰ级为阳性细胞<25%、弱染色;Ⅱ级为阳性细胞在25%~75%之间;Ⅲ级为阳性细胞>75%、强染色。0~Ⅰ级判定为阴性表达;Ⅱ~Ⅲ级判定为阳性表达。在显微镜下取不同放大倍数，拍照、保存结果。
1.3统计学处理应用SPSS11.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组资料的统计学检验采用方差分析，各组均数间的相互比较采用 StudentNewmankeμls法，检验水准α=0.05。
2结果
2.1各组裸鼠移植瘤的成瘤率和移植瘤体积与重量的变化A组和B组裸鼠移植瘤生长迅速,C组裸鼠移植瘤生长缓慢,A、B、C组裸鼠3周时的成瘤率分别为87.5%(7/8)、87.5%(7/8)、37.5%(3/8)，C组显著低于A、B组(P<0.05)。各组5周时的成瘤率均为100%。A、B、C组裸鼠移植瘤5周时的体积分别为(253.49±27.11) mm3、(255.84±26.51) mm3、(125.45±17.49) mm3，C组裸鼠移植瘤的体积显著小于A、B组(P<0.05)。A、B、C组裸鼠移植瘤5周时的重量分别为(1.96±0.17) g、(1.86±0.21) g、(0.97±0.13) g，C组显著低于A、B组(P<0.05)。C组的抑瘤率为(50.79±9.19)%。由此可见，VEGF ASODN+Oligofectamine在裸鼠体内能抑制人胆囊癌GBCSD细胞移植瘤的生长。结果见图1～4。
2.2裸鼠胆囊癌移植瘤的大体病理情况及VEGF、Flt1和KDR蛋白水平的表达情况各组瘤组织的大体病理：A组与B组瘤组织血供丰富，质脆，易出血，浸润周围组织和皮肤，界限不清，不易分离，切面呈鱼肉样，而C组瘤组织与周围组织和皮肤易分离，血供差，切面呈烂鱼肉状，有3例(3/8)瘤组织中央可见液化坏死灶。在光学显微镜下可见在裸鼠胆囊癌移植瘤组织中VEGF、Flt1和KDR蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒，主要分布在肿瘤细胞和血管内皮细胞的细胞浆。A组8例裸鼠胆囊癌移植瘤标本组织中VEGF蛋白阳性表达7例(87.5%)， Flt1蛋白阳性表达6例(75%)，KDR蛋白阳性表达7例(87.5%);B组8例裸鼠胆囊癌移植瘤标本组织中VEGF蛋白阳性表达6例(75%)，Flt1蛋白阳性表达6例(75%)，KDR蛋白阳性表达7例(87.5%);而C组8例裸鼠胆囊癌移植瘤标本组织中VEGF蛋白阳性表达2例(25%)，Flt1蛋白阳性表达1例(12.5%)，KDR蛋白阳性表达2例(25%), A、B组相比无统计学差异 (P>0.05)，A、B组与C组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见图5～7。
3讨论
Warren等[3]通过裸鼠结肠癌肝转移模型的研究证实VEGF参与肿瘤的转移灶的发生发展，VEGF和受体失活能降低肿瘤细胞转移能力，VEGF McAb治疗能显著降低转移灶数目和大小。Claffey等[4]发现黑色素瘤细胞株SKMEL2低表达VEGF，在裸鼠形成弱血管化的肿瘤，通过转染VEGFcDNA后，该细胞株能形成大的血管丰富的肿瘤，转移能力明显增强;给其转染反义VEGF后，生成的肿瘤比原来的血管更少。临床研究也表明VEGF阳性的肿瘤患者较阴性者淋巴结和肝脏转移发生率高，肿瘤早期常有较高的转移。目前普遍认为VEGF的增强血管通透性特性对肿瘤转移有重要作用。研究发现许多人体MVD与肿瘤VEGF表达存在密切关系[5]，与肿瘤分期、转移及预后有关，且VEGF表达增强的肿瘤病人多有血管、淋巴结侵犯和肝脏等脏器转移，病情发展迅速、复发快、术后无复发生存时间短。因此，常单独把组织和血液中VEGF mRNA表达和(或)蛋白水平作为评价肿瘤状况和预后不良的因素[6]。阻断肿瘤血管形成诱导因子与其受体结合或直接应用血管抑制因子是抗血管形成疗法的中心环节，在20多种血管生长因子中，只有VEGF专一作用于血管内皮细胞，是最强和最特异的生长因子，多数的肿瘤均表达高水平的VEGF[7]，并与肿瘤的病理分期及预后密切相关。Samoto等[8]发现，VEGF及其受体是抗血管生成治疗肿瘤的理想靶位。动物实验研究也证实VEGF参与肿瘤的转移灶的发生发展，VEGF和受体失活能降低肿瘤细胞转移能力，故而针对VEGF及其受体的抗肿瘤血管形成治疗近年来已成为肿瘤抗血管治疗的一个重要靶点[9]。Salch等[10]和Im等[11]应用VEGF反义核酸在裸鼠上进行实验，发现VEGF反义核酸技术能有效下调肿瘤细胞的VEGF表达,抑制肿瘤的血管形成，有明显的治疗作用。且直接以肿瘤组织内皮细胞为靶细胞的抗血管形成基因治疗可以避免长期使用肿瘤血管形成抑制因子或促血管形成因子抗体可能诱导肿瘤出现的“耐药现象”，基因治疗的靶向性明确，对正常组织血管形成的影响较小[12]。另外，由于抗肿瘤血管形成基因治疗不受肿瘤细胞周期的影响，故而是其他基因治疗方案的良好补充。
本实验通过裸鼠皮下接种体外培养的人胆囊癌GBCSD细胞建立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型，观察裸鼠的成瘤性，后者是判断细胞恶性增殖的一项重要指标[13]，通过胆囊癌裸鼠移植瘤的免疫组化研究，我们发现VEGF ASODN可以明显抑制VEGF及其受体Flt-1和KDR在蛋白水平的表达，VEGF ASODN的局部应用能够抑制裸鼠人胆囊癌的生长,表现为成瘤的潜伏期延长，瘤重较轻(P<0.05), 瘤体较小(P<0.05)。在各组瘤组织的大体病理观察中我们也发现，B组与A组瘤组织血供丰富，质脆，易出血，浸润周围组织和皮肤，界限不清，不易分离，切面呈鱼肉样，而C组瘤组织与周围组织和皮肤易分离，血供差，切面呈烂鱼肉状，有3例(3/8)瘤组织中央可见液化坏死灶。说明VEGF ASODN的治疗尚可减轻肿瘤的侵袭性，在体内可以明显减少胆囊癌裸鼠移植瘤组织内血管的形成，抑制胆囊癌的生长和转移。但VEGFASODN未能完全抑制肿瘤的生长，说明尚需进一步了解剂量效应关系以及时间效应关系。虽然本实验所采用的寡核苷酸是人工合成的全硫代修饰的SODN和AS0DN，其对核酸酶的抗性增强[14]，且Oligofectamine是一种专门用于寡核苷酸转染的阳离子脂质体，其转染效率较高，但由于肿瘤血管生成多种因素的参与，使VEGF ASODN的抑制肿瘤只呈现有限的作用。
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