宁夏回族癫痫患者ABCB1 C3435T与癫痫耐药相关性研究

　　作者：董通1，许贤瑞1，张庆　　　作者单位：21.宁夏医科大学,银川　750004,

　　【摘要】目的了解宁夏回族癫痫患者ABCB1 C3435T多态性及与癫痫耐药的关系。方法收集宁夏地区回族癫痫患者123例，其中癫痫药物敏感者60例，耐药者63例，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，对两组癫痫患者ABCB1基因C3435T位点的多态性进行检测，并分析其与癫痫耐药的关系。结果耐药组CC基因型和C等位基因频率高于敏感组(P<0.01)。结论宁夏回族癫痫患者中ABCB1 3435CC基因型及C等位基因与癫痫耐药有关，该位点的多态性可能影响癫痫患者对抗癫痫药物的反应性。

　　【关键词】 ABCB1 C3435T,癫痫耐药,回族

　　癫痫的耐药机制一直是研究热点，但尚未阐明。人ABCB1基因(ATP-binding cassette subfamily B member1 transporter gene)，亦称多药耐药基因1(MDR1)，位于第7号染色体的长臂q21.1。近年来研究发现ABCB1基因及其编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)与癫痫多药耐药有关[1-7]。NCBI数据库中显示ABCB1有50多个单核苷酸多态性位点(SNPs)，其中有3个插入和缺失多态性。在目前的癫痫耐药研究中，C3435T位点是研究最多的一个多态性位点。近来的文献[1-7]表明ABCB1 C3435T多态性与癫痫耐药之间存在着一定的相关性，并且存在一定的种族差异性。我们于2010年5-9月间以宁夏回族癫痫患者为研究对象，采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，对123例回族癫痫患者的ABCB1 C3435T多态性进行了研究。

　　1　资料和方法

　　1.1　研究对象及材料

　　1.1.1　研究对象

　　从纳入宁夏农村癫痫示范项目治疗的癫痫患者中，收集无合并其它疾患且无癫痫家族史的回族癫痫患者123例，年龄范围为14 ～61岁，平均35.55岁，其中癫痫耐药患者63例(男30例，女33例，平均35.28岁)，药物敏感癫痫患者60例(男32例，女28例，平均36.51岁)。各组间性别及年龄差异无统计学意义。患者本人或监护人签署知情同意书。

　　耐药分组判定标准参照文献[8-9]。耐药定义：入选本研究前，已经正规应用抗癫药(antiepileptic drugs，AEDs)治疗1年或者1年以上，且AEDs己达临床常用最大剂量，末次随访前1年内其发作频率仍未减少50%，则称为耐药;药物敏感定义：上述同等情况下，如果其发作频率减少50%及以上者，则为药物敏感。入选研究个体均无血缘关系，追溯3代均为回民，且须在宁夏地区居住3代以上。

　　1.1.2　试验仪器及材料

　　Mycycler Thermal Cycler PCR扩增仪(BIO—RAD 美国)、Centriefuge常温高速离心机(日立公司)，DYY-6D电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统(BIO—RAD 意大利米兰)均为宁夏医科大学科技楼实验室提供;全血DNA 提取试剂盒、Go Taq Green Master Mix、DNA Marker 均购自Promega 北京生物技术有限公司;参照文献确定引物[10]，上游引物：5’-ACTCTTGTTTTCAGCTGCTTG-3’;下游引物：5’-AG AGACTTACATTAGGCAGTGACTC-3’。由上海生工生物工程科技有限公司合成。

　　1.2　方法

　　1.2.1　DNA样品制备

　　利用2010年5-9月间收集的123例回族癫痫患者的外周血，采用Promega 北京生物技术有限公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，定量后统一稀释成约70ng?L-1，于4℃冰箱保存备用。

　　1.2.2　PCR扩增及基因分型

　　反应体系为25L，其中每条引物各0.5L(0.1mol?L-1)， Go Taq Green Master Mix,2× 12.5L，去离子水10L。反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火20 s,72℃延伸30 s，循环35次，最后72℃延伸5 min。取PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，在BioRod-Quantity One凝胶成像系统仪上成像检测;每10L PCR扩增产物中加入限制性内切酶DPnⅡ0.5L，于37℃水浴过夜消化14～16h,3.5%琼脂糖凝胶电泳检测后确定ABCB1 C3435T基因型。

　　1.2.3　统计学方法

　　所有数据采用SPSS11.5软件进行统计分析，两组病例分别经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各基因型频率已达遗传平衡，具有群代表性，耐药组和敏感组基因型频率和等位基因频率差异的比较采用双侧χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　ABCB1 C3435T基因分型结果

　　标本DNA经PCR扩增，限制性内切酶DPnⅡ酶切后的基因型有3种：野生纯合型(C/C) 有163bp和68bp两条带;杂合型(C/T)基因型有231bp、163bp和68bp三条带;突变纯合型(T/T)基因型有231bp一条带，见图1。A：DNA Marker，B：CC基因型;C、D：CT基因型;E：TT基因型图1　ABCB1 C3435T基因经PCR扩增、限制性内切酶DPnⅡ酶切后电泳图

　　2.2　两组患者基因型频率分布比较

　　见表1。耐药组63例患者中，C3435T位点CC、CT、TT基因型各为34例、23例、6例;敏感组60例患者中C3435T位点CC、CT、TT基因型分别为12例、29例、19例。耐药组与敏感组比较，CC基因型明显多于敏感组，TT基因型则明显少于敏感组，差异有统计学意义(均P<0.01);两组中CT基因型差异无统计学意义(P>0.05)。表1　耐药组和敏感组癫痫患者ABCB1 C3435T基因型频率分布比较

　　2.3　两组患者等位基因频率分布比较

　　见表2。耐药组C等位基因频率高于敏感组，而T等位基因频率低于敏感组，经χ2检验差异有统计学意义(P<0.001)。表2　耐药组和敏感组癫痫患者ABCB1 C3435T等位基因频率分布比较

　　3　讨论

　　ABCB1及其编码产物P-gp的高表达被认为是引起癫痫耐药的一种机制。P-gp是一种依赖ATP的药物转运蛋白，它能把外源性的化合物主动泵出细胞膜外，因此P-gp既能影响药物的药代动力学又能影响靶细胞的药物累积。在人血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)， P-gp 位于毛细血管近血管腔的一侧和毛细血管外星形胶质细胞足突上，参与构成了BBB [3]。在某种病理情况下如癫痫， 脑内内环境的改变会引起BBB完整性暂时被破坏， 此时P-gp在BBB中的表达增强，能维持BBB的功能， 阻止有害物质进入脑脊液[4]。大多数AEDs是平面亲脂性的药物，是P-gp底物。因此，P-gp可能限制AEDs通过BBB或把进入颅内的AEDs泵出BBB。人体中P-pg由ABCB1和ABCB2两种基因编码，ABCB1编码的P-gp参与了细胞膜上的化合物转运，而ABCB2编码的P-gp不参与细胞膜上的转运。因此人们一直怀疑ABCB1基因多态性及其编码产物P-gp参与了癫痫耐药。

　　在研究ABCB1多态性与癫痫耐药时，研究最多的一个位点就是C3435T。英国学者Siddiqui[1]首先报道了ABCB1基因的3435C>T多态性与癫痫耐药有关——CC型基因型与位于BBB中的P-gp的表达和功能增强有关，从而导致了脑脊液中的AEDs浓度降低。随后世界各地的研究小组对ABCB1基因的C3435T位点多态性进行了相关的研究：南韩[11]、印度[12]研究结果显示C3435T基因型与癫痫耐药无相关性，而日本[13]和中国香港地区[14]的研究结果显示TT基因型与癫痫耐药有相关性。各个研究小组得出了不一致的结果，提示 ABCB1 C3435T基因多态性具有种族差异性。

　　在汉族癫痫患者中的 ABCB1 C3435T多态性的研究相对较多，大多数研究结果认为C3435T位点的CC基因型与癫痫耐药有关，但未见回族癫痫患者的相关研究报道。本研究发现回族癫痫患者中耐药组CC基因型明显高于敏感组;两组病例的C、T等位基因分布显示，C等位基因在耐药组和敏感组的分布频率分别是72.7%、44.8%，T等位基因在两组中的分布频率分别是27.3%、55.2%，耐药组中的C等位基因明显多于敏感组。这说明在回族癫痫患者中 ABCB1 C3435T的CC基因型及C等位基因可能与癫痫耐药有关，与Siddiqui[1]及国内郑兴珍等[7]的研究结果一致。由于本研究患者例数只有123例，还有待于扩大样本量进行同类试验验证。

　　【参考文献】

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