原发性胆汁性肝硬化患者淋巴细胞培养上清液中几种细胞因子水平的测定

　　作者：王少敏 孙建 徐丽娅 作者单位：吉林大学第一医院检验科，吉林 长春 130021　1 长春市民政局军休中心南岭干休所

　　【摘要】目的 探讨几种细胞因子〔白细胞介素(IL)2、肿瘤坏死因子(TNF)α、γ干扰素(IFNγ)、IL4〕水平变化对原发性胆汁性肝硬化(PBC)的诊断价值。方法 酶联免疫吸附(ELISA)法检测经植物血凝素(PHA)刺激后淋巴细胞培养上清液中IL2、TNFα、IFNγ及IL4水平。结果 PBC患者淋巴细胞培养上清液中IL2、TNFα水平与正常对照组比较均明显升高;IFNγ水平与正常对照组比较轻度升高;IL4水平与正常对照组比较无明显变化。 结论 Th1亚群占优势，Th1细胞被激活，介导了自身免疫性损害，导致PBC的发病，推测细胞因子在肝损害中可能起着重要作用。

　　【关键词】 原发性胆汁性肝硬化 细胞因子 外周血淋巴细胞上清液 酶联免疫吸附法

　　目前认为原发性胆汁性肝硬化(PBC)是由自身免疫机制介导的以肝内小胆管进行性非化脓性破坏性炎症为特征的慢性胆汁淤积性疾病，并可进展为肝纤维化与肝硬化〔1〕。临床上90%见于女性，且多见于中老年妇女〔2〕。检测肝组织中T细胞生成的细胞因子，发现同时存在Th1和Th2两组生成不同细胞因子的辅助性T细胞(Th)亚群，以Th1细胞因子为主〔3〕，但有关外周血中T细胞生成的细胞因子水平的研究报道较罕见。本文通过测定PBC外周血淋巴细胞上清液(PBMC)中细胞因子〔白细胞介素(IL)2、肿瘤坏死因子α(TNFα)、γ干扰素(IFNγ)、IL4〕水平，探讨PBC 患者体内T细胞亚群比例失调情况及由其引起的机体免疫功能失调、免疫系统紊乱，为进一步探索PBC的发病机制提供新的依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象

　　2002年9月至2004年3月在本院住院的PBC患者30例，均为女性，年龄38～62岁。均符合临床上PBC的诊断标准：①临床表现符合PBC，除外其他肝内或肝外胆汁淤积，②淤胆性肝功能试验异常，③病理学检查符合PBC的组织学改变。正常对照组20例，为长春血站健康献血者，男4例，女16例，年龄25～46岁。

　　1.2 材料

　　Hank′s液、淋巴细胞分层液(比重1.077)(TBD公司);植物血凝素(PHA)(上海医学化验所);白细胞计数液(2%冰醋酸);培养液IMDM(含10%小牛血清);肝素(丽珠集团苏州新宝制药厂);ELISA试剂盒(TPIINC，UGLG);酶标仪(Model 1550 BIORAD，日本)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 淋巴细胞分离

　　无菌静脉采血10 ml，加肝素抗凝(每ml血含12 U肝素)，将抗凝血缓慢滴入加有淋巴细胞分层液的试管中(二者比例为1∶2)，使血液重叠于分层液之上，采用水平离心机，2 000 r/min离心15 min。可见离心管分出明显两段，吸取上层血浆弃去，小心吸取分层液与血浆之间的淋巴细胞层，置于试管中，加入一定量Hank′s液，混匀后离心15 000 r/min，10 min，弃上清，反复洗3次，分装备用。

　　1.3.2 淋巴细胞培养上清液收集

　　加入含10%小牛血清的IMDM培养液将细胞悬浮，用白细胞稀释液显微镜下计数细胞数，调整细胞浓度为5×106ml，备用。将待测样品按不同稀释度加于96孔培养板中，设三复孔，每孔100 μl，加入已稀释的PHA 100 μl。将培养板置5%CO2、37℃、95%湿度孵箱中，培养30～72 h，随时观察细胞转化情况，在细胞转化最适宜时间，1 000 r/min离心10 min，收集上清分装标记，置-30℃保存。

　　1.3.3 酶联免疫吸附(ELISA)法

　　检测淋巴细胞培养上清液(PHA刺激前后)中IL2、TNFα、IFNγ及IL4水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

　　1.4 统计学处理

　　数据用x±s表示，并用t检验。

　　2 结 果

　　PBC患者IL2与正常对照组比较明显升高,差异有显著性(P<0.05); TNFα水平与正常对照组比较显著升高,差异有显著性(P<0.01); PBC患者IFNγ水平与正常对照组比较轻度升高，IL4水平较正常对照组比较无明显变化，差异无显著性(P>0.05)(见表1)。表1 PBC患者淋巴细胞培养上清IL2、TNFα、IFNγ及 IL4水平(略)

　　3 讨 论

　　PBC是自身免疫性胆汁淤积性疾病，抗线粒体抗体(AMA)为其特征性免疫学标志〔4〕。PBC病人的胆管壁及其周围有大量的T淋巴细胞浸润，且体外试验表明PBC病人的淋巴细胞可导致自体胆管上皮细胞坏死，因此有理由推测T淋巴细胞参与了PBC的发病过程，但CD4+与CD8+T淋巴细胞谁占主导地位却存在争议，PBC时细胞因子的变化在不同的研究中报道不一致。有研究证实Th1生成的IFNγ和IL2在PBC病人的肝组织和分离的抗原特异性T细胞中均显著增高，而IL4却较低，提示Th1亚群占优势〔5〕。Berg〔6〕等通过研究PBC病人细胞因子基础表达和未被激活的肝脏浸润细胞或PBC病人细胞因子基因表达和未被激活的肝脏浸润细胞或PBMC细胞因子类型，发现PBC病人Th1/Th2型因子比率为1∶1，并认为PBC主要是Th1细胞被激活，其介导了自身免疫性损害。Van de Water〔7〕等从PBC患者肝脏中分离出PDCE2等特异性T细胞克隆，测得其分泌IL2或IFNγ，或二者都分泌，但不产生IL4。也有研究表明PBC病人肝脏浸润细胞或PBMC主要分泌Th2 型细胞因子。鉴于上述报道得出的不同结果，本研究经PHA刺激后，检测PBC病人外周血淋巴细胞转化的上清液中的细胞因子(IL2、TNFα、IFNγ、IL4)水平，发现PBC患者体内IL2分泌明显增高，IL2主要由活化的T细胞，尤其是CD4+T细胞及NK细胞分泌，属于Th1细胞因子，可以诱导T淋巴细胞的增殖，淋巴细胞过度活化，NK细胞与CTL杀伤活性下降，推测PBC的发病是Th1占优势。TNFα分泌明显高于对照组，TNFα分泌增高，可激活巨噬细胞，导致炎症介质产生，这些炎症介质始终参与免疫调节过程，故认为PBC的发病是可能是由Ⅱ型超敏反应所致。本研究中通过测定外周血IL4水平无明显改变，但IL2、TNFα、IFNγ分泌增高，提示Th1亚群占优势，Th1细胞被激活，其介导了自身免疫性损害，导致PBC的发病，推测细胞因子在肝损害中可能起着重要作用。由于PBC女性患者多发，且无少儿患者，推测PBC的发病除免疫因素外，可能还与内分泌或环境因素有关〔8〕。细胞因子在PBC发病机制中的确切作用机制尚无统一认识，寻找有效方法调节患者体内上述细胞因子水平，从而调节体内Th1/Th2平衡状态，将为上述自身免疫性疾病治疗开辟一条新途径。

　　【参考文献】

　　1 Neuberger J.Primary biliary cirrhosis〔J〕.Lancet，1997;350(9081)：8759.

　　2 仲人前，孔宪涛.自身免疫性肝病〔M〕.上海：科学技术出版社，1996：94105.

　　3 Dienes HP，Lohse AW，Gerken G，et al.Bile duct epithelia as target cells in primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis〔J〕.Virchows Arch，1997;431(2)：11924.

　　4 Mackay IR,Gershwin ME.The nature of autoimmune disease〔J〕.Semin Liver Dis,1997;17:312.

　　5 潘淑荣.原发性胆汁性肝硬化患者免疫学研究〔J〕.临床肝胆病杂志，1989;5(3):145.

　　6 Berg P,Klein R,Rocken M.Cytokines in primary biliary cirrhosis〔J〕.Se min Liver Dis,1997;17:11523.

　　7 Van de Water， Jnsari A，Prindivelle T,et al.Heterogeneity of autoreactive T cell clones specific for the E2 component of the pyruvate dehydrogenase complex in primary biliary cirrhosis〔J〕.J Exp Med,1995;181:72333.

　　8 Kim WR，Lindor KU，Loclcos GR，et al.Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in US community〔J〕.Gastroentesology，2000;119(6):1631.