胆囊良恶性病变组织中肿瘤相关巨噬细胞及微血管和淋巴管计数

　　作者：李清龙， 杨竹林， 杨晓静， 罗鑫， 付汐， 苗雄鹰 作者单位：( 中南大学湘雅二医院肝胆外科， 湖南 长沙 410011 )

　　【摘要】 【目的】 研究胆囊良恶性病变组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、微血管(MV)和淋巴管计数(LV)，探讨其临床病理意义及在胆囊腺癌中相互关系。【方法】 108例胆囊腺癌、46例癌旁组织、15例腺瘤性息肉和35例慢性胆囊炎手术切除标本常规制作石蜡包埋切片，TAM、MV和LV染色均为SP免疫组化法，高倍光镜下随机计数10个视野。【结果】 胆囊腺癌TAM、MV和LV计数明显地高于癌旁组织、腺瘤性息肉和慢性胆囊炎(P < 0.01);腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径 ≤ 2 cm、无淋巴结转移及周围组织未侵犯病例TAM、MV和LV计数明显低于低分化腺癌、肿块最大径 > 2 cm、淋巴结转移及侵犯周围组织病例(P < 0.05);胆囊腺癌中TAM计数与MV和LV计数均存在高度密切正相关(TAM与MV，r=0.65，P < 0.01;TAM与LV，r=0.58， P < 0.01; MV与LV， r = 0.32， P < 0.05)。【结论】 TAM，MV 和LV计数可能是反映胆囊癌发生、进展、生物学行为、转移或侵袭潜力及预后的重要生物学标记物，TAM浸润可能与肿瘤血管和淋巴管生成有关。

　　【关键词】 胆囊肿瘤; 腺瘤性息肉; 慢性胆囊炎; 肿瘤相关巨噬细胞; 血管生成; 淋巴管生成; 免疫组织化学

　　Counts of Tumor-associated Macrophage， Microvessel and Lymph Vessel in Benign and Malignant Lesions of Gallbladder

　　LI Qing-long， YANG Zhu-ling， YANG Xiao-jing， LUO Xing， FU Xi， MIAO Xiong-ying

　　( Research Lab of Hepatobiliary Diseases， The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011， China )

　　Abtract： 【Objective】 To study the counts of tumor-associated macrophage (TAM)， microvessel (MV) and lymph vessel (LV)　in gallbladder adenocarcinoma， peritumoral tissues， adenomatous polyp and chronic cholecystitis with regard to their diagnostic and prognostic value from a clinicopathological perspective. 【Methods】 SP immuno-histochemistry method was used for the stain of TAM， MV， and LV in routinely paraffin-embedded sections from the samples of gallbladder adenocarcinoma (n=108)， peritumoral tissues (n=46)， adenomatous polyp (n=15)， and chronic cholecystitis (n=35)， followed by positive-counting on 10 random field under high power microscope. 【Results】 The counts of TAM， MV， and LV were significantly higher in the gallbladder adenocarcinorna than those in the peritumoral tissues， adenomatous polyp， and chronic cholecystitis (P < 0.01). The counts of TAM， MV， and LV were significantly lowered when the tumor were cancerate from adenomatous polyp， or well-differentiated， or less than 2 cm in the maximal diameter， or negative in lymphatic involvement and peritumoral infiltration (P < 0.05). Significant positive-correlation were found among the counts of TAM and MV and LV in gallbladder adenocarcinorna (correlation coefficient： TAM vs MV， r=0.65， P < 0.01; TAM vs LV， r=0.58， P < 0.01; MV vs LV， r=0.32， P < 0.05). 【Conclusions】 The counts of TAM， MV， or LV presented as important factors associated with carcinogenesis， advancement， biological behavior， metastasis， invasive potential and prognosis of gallbladder carcinoma， TAM deposit might indicating the angiogenesis and lymphoangiogenesis of gallbladder adenocarcinoma.

　　Key words： gallbladder neoplasms; adenomatous polyp; chronic cholecystitis; tumor-associated macrophage;

　　近年研究发现恶性肿瘤内浸润的巨噬细胞分化成肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)，其数量与恶性肿瘤进展、血管生成及转移发生的预后密切相关。大量文献证实肿瘤微血管(microvessel， MV)生成密度与恶性肿瘤进展、转移或复发密切相关，在许多恶性肿瘤内被认为是一个仅次于淋巴结转移的预后预测因子[1，4]。D2-40为新近发现标记淋巴管的特异性和敏感性均高的单克隆抗体，它不标记血管内皮细胞，故可用于淋巴管(lymph vessel， LV)计数[5]。近年研究显示LV计数与恶性肿瘤进展、转移及预后也密切相关[5-9]。新近国外学者发现一些恶性肿瘤中TAM通过旁分泌和自分泌途径具有促进MV和LV生成作用[1，2，4]，但国内外尚未见胆囊癌方面研究的文献报道。作者应用SP免疫组化法研究108例胆囊腺癌、46例癌旁组织、15例腺瘤性息肉和35例慢性胆囊炎组织中TAM、MV和LV计数，探讨他们的临床病理意义及其在胆囊腺癌中的相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本及其临床病理资料

　　收集中南大学湘雅二医院、湘雅医院和湖南省人民医院1996年6月至2006年6月胆囊癌手术切除标本108例，男性31例(28.7%)，女性77例(71.3%)。病理类型均为腺癌，其中腺瘤癌变9例(8.2%)，高分化腺癌29例(26.9%)，中分化腺癌29例(26.9%)，低分化腺癌30例(27.8%)，黏液腺癌11例(10.2%);术中发现侵犯胆囊外周围组织器官59例(54.6%);共有59例发生区域淋巴结转移(54.6%);58例伴有胆囊结石(53.7%);手术方式包括根治性切除34例(31.5%)，姑息手术48例(44.4%)和因广泛转移不能手术26例(24.1%)。从以上108例胆囊腺癌中选择46例癌旁组织(距癌组织≥3 mm)，病理证实其中正常10例、轻度不典型增生10例、中度不典型增生12例和重度不典型增生14例。收集中南大学湘雅二医院1996年6月至2006年胆囊腺瘤性息肉手术切除标本15例，男性5例(33.3%)，女性10例(66.7%)，年龄范围42 ～ 60岁，平均51.8(S=11.6)岁，病理息肉大小为0.08 ～ 15 mm;病理证实均为腺瘤性息肉，其中中至重度不典型增生5例(33.3%)。另收集35例慢性胆囊炎组织标本(单纯慢性胆囊炎15例、慢性胆囊炎伴胆囊结石20例)作为对照，其中正常胆囊黏膜11例、轻度不典型增生12例、中度不典型增生7例及重度不典型增生5例。以上标本经40 g/L甲醛固定后常规制作石蜡包埋切片，切片厚4 μm。

　　1.2 主要试剂

　　鼠抗人CD68、CD34和D2-40单克隆抗体，鼠SP试剂盒，DAB-HCL显色试剂盒均购自北京中杉生物技术公司。

　　1.3 方法

　　TAM、MV和LV染色方法均为常规SP免疫组化法(染色步骤略)。TAM、MV和LV计数方法：在低倍镜下随机选择TAM、MV和LV分布丰富的10个区域，在高倍镜下计数10个区域内TAM、MV和LV数，取其均值为该病例计数值。

　　1.4 统计学处理

　　将所得数据输入SPSS11.0统计软件包，病理类型组内均值之间行F检验，两组均值之间行t检验，两组数值之间相关分析采用Spearman?蒺s等级相关分析法。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 胆囊良恶性病变TAM、MV和LV计数情况

　　TAM免疫组化反应产物定位于胞浆，部分胞核着色，TAM分布癌周间质和癌组织内(图1A)。MV和LV免疫组化产物定位于内皮细胞胞浆，阳性表达的MV和LV多呈类园形或条索状，均计数为一个MV和LV(图1B、C)。胆囊腺癌TAM，MV和LV计数均值均明显地高于癌旁组织，腺瘤性息肉和慢性胆囊炎组织，差异均有统计学意义(P < 0.01;表1)。

　　2.2 TAM，MV和LV 计数与胆囊腺癌临床病理特征的关系

　　胆囊腺瘤癌变或高分化腺癌，肿块最大径≤2 cm，无淋巴结转移及未侵犯周围组织病例TAM，MV和LV计数明显低于低分化腺癌，肿块最大径 > 2 cm， 淋巴结转移及侵犯周围组织病例，差异均有显著或高度显著性(P < 0.05或P < 0.01)，见表2。三者计数均与性别、年龄及有无胆囊结石等临床特征无明显关系(P > 0.05)。

　　2.3 TAM、MV和LV计数在胆囊腺癌中相互关系

　　经Spearman?蒺s等级相关分析，TAM汁数与MV和LV计数均呈高度密切正相关(MV：r=0.65，P < 0.01;LV：r = 0.58，P < 0.01);同样MV计数与LV计数之间也存在密切正相关(r = 0.32，P < 0.05)。

　　3 讨论

　　基因蛋白表达、细胞表面粘附分子表达在胆囊癌的形成、淋巴结转移和病程进展等方面研究相对较多[10，11]。肿瘤相关巨噬细胞与胆囊癌的形成及生物学行为方面研究国内外尚未见文献报道。巨噬细胞是单核巨噬细胞系统内某个时期的分化类型，是肿瘤间质中炎性细胞浸润的一个关键成分，单核巨噬细胞在癌间质内通常分化为TAM，与肿瘤血管生成关系密切。最近，一些文献报道恶性肿瘤中TAM计数高者进展快、易发生转移及预后差，TAM可作为恶性肿瘤预后评估的客观指标[1-4]。其机理可能与TAM通过自分泌途径分泌许多生长刺激因子和抑制细胞因子及蛋白水解酶有关，也可能通过旁分泌机制与癌细胞相互作用有关，其确切机制仍不清楚[1-4]。肿瘤的生长和转移均需血管生成。近年大量文献证实肿瘤MV生成与恶性肿瘤转移和预后密切相关，MV定量高者易发生转移和预后差，MV计数是一个仅次于区域淋巴结转移的重要预后预测因子[1，4]。

　　肿瘤胚胎性抗原M2A是一种40 ku的唾液酸糖蛋白，在成年个体，淋巴管内皮细胞表达M2A，但血管内皮细胞不表达该抗原。D2-40可识别M2A的一个固定抗原表位，在实验研究中可用来标记淋巴管内皮，以区别于血管内皮，被认为是最具有特异性淋巴管标记物[5]。肿瘤诱导的淋巴管生成是肿瘤淋巴管转移的重要步骤[6，7]。新生淋巴管仅由单层细胞组成，无基底层，细胞间紧密连接少，有许多潜在腔隙等因素都有利于肿瘤细胞进入淋巴管。肿瘤淋巴管生成造成淋巴管密度增加，使肿瘤细胞有更多的机会侵入毛细淋巴管进入区域淋巴结，形成淋巴道转移[2，5-9]。且进一步发现LV除与淋巴道转移有关外，也与恶性肿瘤进展、血道转移及预后密切相关，LV计数高者进展快，易发生血道转移及预后差[2，5-9]。

　　本组资料发现，胆囊腺癌TAM、MV和LV计数明显高于癌旁组织、腺瘤性息肉和慢性胆囊炎组织。腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径≤ 2 cm，无淋巴结转移和未侵犯周围组织病例TAM、MV和LV计数明显低于低分化腺癌、肿块最大径 > 2 cm、淋巴结转移和侵犯周围组织病例。其结果与国外文献报道较一致，说明TAM、MV和LV计数与胆囊腺癌进展，转移及侵袭潜力有密切关系，TAM、MV和LV可能是反映胆囊腺癌预后的重要客观指标。

　　研究发现TAM通过自分泌和旁分泌途径在肿瘤血管生成中的级联反应中起重要作用，除产生VEGF、bFGF、PDGF及IL-8等化学超化因子外，可提高VEGF和bFGF在血管内皮中表达水平，从而促进肿瘤血管生成[1，3，4]。新近国外学者发现TAM除促进血管生成外，通过其自分泌的VEGF-C及影响肿瘤细胞分泌VEGF-C和VEGF-D的作用途径，具有明显促肿瘤淋巴管生成作用[2，3，6]。本组资料发现胆囊腺癌中TAM计数与MV计数、LV计数呈密切正相关，说明胆囊腺癌中浸润的TAM可能具有促肿瘤血管和淋巴管生成作用，其机制尚需更深入研究。

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