三氧化二砷抑制人肝癌细胞侵袭性的体外研究

　　作者：周艳，于志坚 作者单位：(1南通大学医学院生物化学教研室，南通226001;2南通大学附属医院)

　　【摘要】 目的：研究三氧化二砷(As2O3)对人肝癌SMMC-7721细胞侵袭能力的影响,为As2O3用于原发性肝癌的治疗提供实验依据。方法：以0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml 的As2O3与人肝癌细胞株SMMC-7721孵育24、48和72 h后，应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)观察As2O3对细胞生长的影响;应用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和运动实验，观察As2O3对肝癌细胞侵袭能力的影响。结果： 应用As2O3处理后人肝癌SMMC-7721细胞生长受到抑制，且有时间-浓度依赖性;同时肝癌细胞过膜细胞数减少，侵袭能力受到抑制。结论：As2O3在体外能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和侵袭能力，且有浓度依赖性。

　　【关键词】 三氧化二砷;肝癌细胞株;侵袭

　　Effects of arsenic trioxide on suppression of human hepatocellular carcinoma cells invasion in vitro ZHOU Yan1，YU Zhijian2 (1Department of Biochemistry，Nantong Medical college，Nantong 226001， 2Affilated Hospital of Nantong University Nantong University)

　　[Abstract] Objective:To study the effects of arsenic trioxide(As2O3) with different density on invasion in human hepatocelular carcinoma cell line SMMC-7721, and to give grounds for HCC therapy with As2O3. Methods：The human hepatocelular carcinoma cell line SMMC-7721 were cultured in vitro and treated with 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml As2O3 for 24、48 and 72 h, respectively. Then observed and analyzed by MTT assay, to detect the inhibitory rate of As2O3. Transwell chamber membrane invasion culture system was used to study the invasion.Results：After the SMMC-7721 cells were treated with As2O3, the proliferation of cells was inhibited in a time and dose-depending manner. The invasion of SMMC-7721 cell was also inhibited, passing-membrance cells markedly decreased compared with the control (P<0.01). Conclusion：The proliferation and invasion ability of SMMC-7721 cells was markedly inhibited by As2O3 in a dose-dependent manner in vitro.

　　[Key words] Arsenic trioxide; Hepatocelular carcinoma; Invasion

　　原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一, 病死率高, 复发转移是影响预后的最主要因素。临床资料显示，约60%以上的肝癌(含早期肝癌)确诊时已发生临床或显微镜下转移[1]。因此抗侵袭转移, 减少术后复发成为目前研究的热点和难点。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)在治疗急性早幼粒性白血病(APL)，已经取得了很大的进展[2]。新近研究发现，三氧化二砷有可能抑制肿瘤的转移。为此我们主要研究As2O3对人肝癌细胞株SMMC-7721生长及侵袭力的影响进行研究，为As2O3在临床用于肝癌的治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人肝癌细胞株SMMC-7721引自中国科学院上海细胞生物研究所。亚砷酸注射液(As2O3，哈尔滨伊达药业有限公司); RPMI-1640培养基(GIBCO BRI，USA);小牛血清(上海实生细胞生物技术有限公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(购自美国Sigma公司);Transwell侵袭小室(美国CORNING公司)，Matrigel基质胶(美国BD公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 肝癌细胞株SMMC-7721生长于含10%胎牛血清及青、链霉素各100 U/ml的 RPMI-1640培养液中，细胞置于37 ℃体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每2天换1次液，取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2.2 MTT法检测抑制率 取生长良好的肝癌细胞，调整细胞浓度至(1~5)×105个/ml，接种于96孔培养板内，待细胞贴壁后弃去上清，实验组分别加入不同浓度的As2O3(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml)，对照组加入不含药物的培养基。每组设3个复孔，实验重复2次以上。放入CO2培养箱内培养24、48、72 h，然后每孔加MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，再培养4 h，弃上清，每孔加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)振荡，使结晶完全溶解，在全自动酶标仪上比色，在波长为570 nm处测定每孔的吸光度(A值)。按照下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%)=(1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。

　　1.2.3 侵袭性实验 120 μl matrigel基质胶加入960 μl无血清培养基，混匀，加入上室各80 μl，室温孵育1 h;吸出培养板中残余液体，用含0.2 % BSA(10 mg/ml)BSA无血清培养基冲洗1次;消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗2遍，用含10 mg/mlBSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×105，分对照组，药物干预组(As2O3 0.25、0.5 μg/ml),每组设5个复孔;上室每孔加入100 μl细胞悬液;下腔室中加入600 μl含有10%FBS条件培养基;37 ℃培养箱中，孵育24 h;取出transwell用PBS洗2遍;待膜风干后加入瑞士染液染色，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察;随机于镜下取上、下、左、右、中心5个视野，计数穿膜细胞数，取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的体外侵袭能力。侵袭抑制率(%)=(1-实验组细胞数/对照组细胞数)×100%，实验重复3次。

　　1.2.4 统计学方法 以x±s表示。数据以Stata7.0统计软件处理，采用方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 As2O3对SMMC-7721细胞株增殖的影响 MTT法检测发现0.25~4.0 μg/ml 浓度范围内的As2O3对肝癌细胞SMMC-7721生长抑制具有时间和浓度依赖性，时间越长，浓度越大对肝癌细胞的抑制作用就越大，见图1。

　　2.2 As2O3对SMMC-7721细胞体外侵袭能力的抑制作用 由表1、图2(见封三)可见，As2O3处理后的SMMC-7721细胞侵袭能力下降。孵育24 h后对照组SMMC-7721细胞过膜较多，细胞铺展，呈梭形，体外侵袭能力较强;随着As2O3药物浓度提高，SMMC-7721过膜细胞减少，显微镜下可见细胞形状不规则，皱缩变圆，有出泡现象。与对照组相比，0.25 μg/ml As2O3干预组侵袭抑制率增加了53.9%，0.5 μg/ml As2O3干预组侵袭抑制率增加了71.7%。结果表明，As2O3可明显抑制SMMC-7721细胞的体外侵袭能力，且抑制作用呈剂量效应关系。

　　3 讨 论

　　近年国内外的流行病学调查和实验研究均表明，As2O3对胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、白血病等多种肿瘤均有明显抑制作用[3-9]。目前国内外对As2O3抗肿瘤作用机制的研究很多，提示了As2O3通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制致癌基因表达、相关酶活性、细胞运动、抗血管新生、逆转多重耐药等作用机制发挥抗肿瘤作用。本实验结果表明As2O3在体外可抑制肝癌细胞的生长，且具有明显的时间和浓度依赖性。提示As2O3在一定范围内药物浓度越高，用药时间越长，抗肿瘤效果越好。但由于静脉给药到达肿瘤组织的药物浓度相对较低，而加大剂量又会增加药物的毒性，因此临床多经肿瘤的供养动脉灌注，同等剂量下可增加肿瘤组织的药物浓度，增加抗肿瘤效应。

　　肿瘤侵袭和转移是瘤细胞穿过细胞外基质屏障、血管壁的基底膜及穿出血管壁进人宿主微环境等环节[10]，即肿瘤细胞通过表面特定受体于基质或基底膜的层黏连蛋白(laminin,LN)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)和Ⅳ型胶原等相黏连，肿瘤细胞释放蛋白水解酶或激活基质中已存在的酶原使基质成分降解，然后肿瘤细胞运动而充填到被水解的基质的空隙处，此过程不断重复从而肿瘤细胞不断向深层侵袭。本实验采用的Transwell侵袭小室是一种装有微孔聚碳酸酯膜的特殊培养小室，直径8 μm。Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、Ⅳ型胶原等。将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可穿过多孔滤膜，因此可模拟肿瘤细胞在体内的侵袭转移过程，并以穿过Matrigel膜的细胞数来表示细胞的侵袭能力。本实验中侵袭细胞经染色后在显微镜下观察和计数，结果显示，对照组与各实验组细胞均能够穿过铺有人工基质Matrigel的滤膜。与对照组比较，As2O3组侵袭、趋化细胞数均明显减少 (P<0.01)，因而它具有体外抑制肝癌细胞转移的作用。我们研究结果与文献一致[11-12]。

　　总之，As2O3在体外不仅可抑制肝癌细胞的生长，还可抑制肝癌细胞的侵袭能力。对As2O3抑制肝癌侵袭转移的分子机制和临床治疗学意义的进一步深入研究，必将为肝癌治疗展示出新的前景。

　　【参考文献】

　　[1] 彭叔牖,刘建生.生长抑素及其受体与肝癌[J].世界华人消化杂志,2000,8(12):1323-1325.

　　[2] 张鹏,邓秀芝,刘艳平.三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病[J].白血病,1999,8(4):195-196.

　　[3] 赵园园,金锋,梁军,等.三氧化二砷对人胃癌耐药细胞系SGC7901/ADM耐药逆转及凋亡诱导作用的探讨[J].中国肿瘤临床,2005,32(11):611-613.

　　[4] 王南瑶,刘琳,邱少敏,等.三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响[J].东南大学学报(医学版),2005,24(3):168-170.

　　[5] Oketani M, Kohara K, Tuvdendorj D, et al. Inhibition by arsenic trioxide of human hepatpma cell growth[J]. Cancer Lett, 2002, 183(2):147-150.

　　[6] Olie RA，Simocs-W ust AP，Baumann B，et a1.A novel antisense oligonucleotide targeting surviving expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemo therapy [J]. Cancer Res，2000, 60(11): 2805-2809.

　　[7] 阳东荣,陈昭典,单玉喜.三氧化二砷对前列腺癌PC-3细胞生长及survivin基因表达的影响[J].实用肿瘤杂志,2006,21(1):56-59.

　　[8] 姚茂金,李洁,方建珍,等.三氧化二砷诱导人膀胱癌T24细胞凋亡的实验研究[J].实用肿瘤杂志,2007,22(4):332-335.

　　[9] 王涛,马梁明,张华屏,等.三氧化二砷联合丁硫氨酸亚砜胺诱导人白血病K562/ADM细胞凋亡[J].中华肿瘤杂志,2008,30(3):188-190.

　　[10] Liotta LA. Tumor invasion and metastasis role of the extracelluar matrix：Rhoads memorial award lecture[J].Cancer Res,1986,46(1):1-7.

　　[11] 华海清,秦叔逵,王锦鸿,等.三氧化二砷对人肝癌细胞黏附和侵袭影响的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2004,24(10):922-925.

　　[12] Du CW, Wen BG, Li DR, et a1. Arsenic trioxide reduces the invasive and metastatic properties of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro[J].Braz J Med Biol Res,2006,39(5): 677-685.