转化生长因子β1及其Ⅱ型受体在慢性胰腺炎大鼠中的表达

　　作者：张淑坤，崔乃强，王艳妮，李东华，么国旺 作者单位：(天津市中西医结合急腹症研究所，天津 300100)

　　【摘要】 目的 建立大鼠慢性胰腺炎模型，检测模型大鼠胰腺组织转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGFβ1)及转化生长因子β1Ⅱ型受体(transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor，TβRⅡ) mRNA的表达。方法 24只健康雄性Wistar大鼠，随机分为2组：模型组大鼠尾静脉注射二丁基二氯化物 (dibutyltin dichloride，DBTC) 溶液7 mg/kg，对照组仅注射相同体积的溶剂，28 d时剖杀动物，采用HE染色和Masson染色观察两组大鼠胰腺组织病理变化，采用荧光定量PCR检测TGFβ1和TβRⅡmRNA在胰腺组织的表达。结果 模型组大鼠胰腺组织镜下可见纤维组织增生明显，胰腺小叶结构破坏或消失，腺泡萎缩;与对照组相比，模型组大鼠胰腺组织TGFβ1和TβRⅡmRNA表达均升高(P<0.05)。结论 TGFβ1和TβRⅡ在DBTC诱导的大鼠慢性胰腺炎胰腺组织表达升高。

　　【关键词】 转化生长因子β1;转化生长因子β1Ⅱ型受体;慢性胰腺炎;二丁基二氯化物;大鼠

　　Expression of transforming growth factor-β1 and its type Ⅱ receptor in rats with chronic pancreatitis

　　ZHANG Shukun， CUI Naiqiang， WANG Yanni， et al. Institute of Acute Abdominal Disease of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Tianjin 300100

　　Abstract Objective To detect the mRNA expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor (TβRⅡ) in pancreatic tissues of rats model with chronic pancreatitis. Methods Twenty-four healthy male Wistar rats were randomly divided into two groups： the control group and model group (n=10 per each group). Rat chronic pancreatitis model was induced by dibutyltin dichloride injection of (DBTC) into the right caudal vein with a syringe at a dose of 7 mg/kg body weight. The control group was treated only with solvent. Pancreatic tissues were collected after 28-day feeding， hematoxylin and eosin (HE) staining and masson trichrome staining were carried out to observe the pathological changes of pancrease， and the mRNA expression of TGF-β1 and TβRⅡ was detected using real-time PCR. Results The mRNA expression of TGF-β1 and TβRⅡ was all increased in model group compared with the control group (P<0.05). Conclusion The mRNA expression of TGF-β1 and TβRⅡ is increased in pancreatic tissues of rat with chronic pancreatitis model induced with DBTC.

　　Key words transforming growth factor-β1; transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor; chronic pancreatitis; dibutyltin dichloride; rats

　　慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是一种难治性消化系统常见病，胰腺实质纤维化是CP的最主要病理特征。这种纤维化是进行性、不可逆的，最终导致胰腺基本的内、外分泌功能丧失。对胰腺纤维化形成机制的研究一直是消化内、外科领域极力攻克的重要课题，但目前尚无定论。国外研究发现，转基因小鼠和自发性CP大鼠的转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)能促进胶原的沉积，有促胰腺纤维化作用[1-2]。国内有研究表明，TGF-β1在CP和胰腺癌患者胰腺组织表达的阳性率升高[3]，还观察到在手术结扎胰管制备的犬CP模型中TGF-β1持续高表达[4]。但对于TGF-β1在二丁基二氯化物(dibutyltin dichloride，DBTC)诱导的大鼠CP模型发生中作用的研究尚鲜见报道。本实验采用尾静脉注射DBTC诱导大鼠CP模型，并用荧光定量PCR技术初步观察了胰腺组织TGF-β1及转化生长因子β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)的mRNA表达，为探讨慢性胰腺炎胰腺纤维化的发病机制提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 DBTC购自美国Sigma 公司，淀粉酶和脂肪酶测定试剂盒购自北京利德曼生化技术有限公司。SV总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自美国Promega公司，Real-time Master Mix购自北京Tiangen公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。iCycler iQTM Multicolor Real-Time PCR 检测系统为美国Bio-Rad公司产品。

　　1.2 大鼠CP模型的建立和处理 健康雄性Wistar大鼠，体质量170～200 g，由中国医学科学院放射研究所实验动物中心提供。24只大鼠随机分为2组：模型组(n=12)大鼠尾静脉注射DBTC溶液 (7 mg/kg，DBTC先溶于1份100%乙醇，然后再与2份甘油和2份二甲亚砜混合配制成DBTC溶液)[5]，对照组(n=12)大鼠尾静脉仅注射相同体积的乙醇、甘油和二甲基亚砜。分笼常规饲养28 d。剖杀前禁食水12 h，腹腔注射100 mL/L水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，无菌条件下开腹，下腔静脉取血用于血清淀粉酶、脂肪酶检测。完整切取大鼠胰腺组织，40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，3～4 ?滋m连续切片，HE染色用于进行组织学观察，或在大鼠完整胰腺组织加入RNA Lysis Buffer匀浆后于-70℃保存。

　　1.3 总RNA提取和real-time PCR 取150 μL胰腺组织匀浆液按试剂盒说明提取总RNA。经纯度鉴定和浓度测定后，取1.0 μg总RNA行逆转录。2.0 μl的cDNA 行real-time PCR，TGFβ1上游引物：5′-CTCAACACCTGCACAGCTCC-3′，下游引物：5′-AGTTGGCATGGTAGCCCTTG-3′，扩增片段长度159 bp;TβRⅡ上游引物：5′-CCC TACTCTGTCTGTGGATGA-3′，下游引物：5′-GACGTCATTTCCCAGAGTAC-3′，扩增片段长度152 bp;内参HPRT上游引物：5′-CATGTTTGTGTCATCAGCG-3′，下游引物：5′-ACTAAGTAGATGGCCACAG-3′，扩增片段长度139 bp。25 μL反应体系，反应参数：95℃变性3 min，之后95℃变性20 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40个循环。目的基因的相对表达量用内参和目的基因的Ct值之差表示。

　　1.4 统计学方法 采用独立样本的t检验。

　　2 结果

　　2.1 胰腺肉眼所见 对照组大鼠胰腺饱满，表面光滑，呈淡红色。模型组大鼠胰腺表面不规则、粗糙，颜色变浅或呈苍白色，有的出现不同程度的胆总管扩张。

　　2.2 血清淀粉酶和脂肪酶 与对照组比较，模型组血清淀粉酶和脂肪酶变化无统计学意义[(2024±307)U/L比(1895±300)U/L，P>0.05和(26.50±10.97)U/L比(23.50±11.68)U/L，P>0.05]。

　　2.3 胰腺病理学改变 慢性胰腺炎大鼠胰腺组织HE染色，镜下可见纤维组织增生明显，胰腺小叶结构破坏或消失，腺泡萎缩变形(见图1A)。对照组胰腺小叶轮廓清晰，分布均匀，小叶间结缔组织中可见胰导管及血管等，腺泡细胞呈锥体形，胞浆丰满，细胞核呈圆形位于基底部，排列整齐(见图1B)。每个切片随机选取一个视野，根据炎细胞浸润、腺泡萎缩和纤维化在整个视野所占的比例进行病理学评分：0—0%，1—0%~25%，2—25%~50%和3—50%~100%[3]。模型组大鼠各项病理学评分均较对照组升高有统计学意义(P<0.05，见表1)。

　　2.4 胰腺组织TGF-β1和TβRⅡmRNA表达 模型组TGF-β1和TβRⅡ的mRNA表达较对照组升高均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

　　3 讨论

　　TGF-β1是目前已知的与器官纤维化形成关系最为密切的细胞因子，它能作用于多个环节，刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积，在绝大多数以胶原过度沉积为特征的纤维化疾病中均发挥重要作用。TGF-β1在生理状态下由淋巴细胞、巨噬细胞、血小板等分泌，在慢性胰腺炎时还可由PSC、腺泡细胞通过旁分泌和自分泌而激活PSC。研究表明，TGF-β1通过上调体外培养PSC的I型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白等mRNA表达和抑制基质金属蛋白酶和促进蛋白酶抑制因子的分泌，来促进细胞外基质的合成和减少降解[6-7]。我们的研究采用real-time PCR技术检测了慢性胰腺炎大鼠胰腺组织TGF-β1及TβRⅡmRNA的表达，结果发现TGF-β1和TβRⅡ的mRNA表达水平在慢性胰腺炎大鼠升高，证实TGF-β1是胰腺组织的致纤维化因子，并提示TGF-β1可能通过上调相应受体的表达，在大鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化发生和发展过程中起重要作用。

　　大鼠胰腺对DBTC具有高度亲和性和浓聚性，DBTC能破坏腺泡细胞及胰管上皮细胞，诱导胰腺炎的发生，炎症后期胰腺小叶结构破坏，导致广泛的间质纤维化。以往的研究认为DBTC诱导大鼠CP 以纤维组织沉积动态发展为其主要特征，整个病程炎性细胞持续浸润，与人类CP 病程极为相似，是适合研究CP的一种动物模型[3]。我们在大鼠尾静脉注射DBTC后28 d的胰腺组织也观察到大量的纤维组织增生，腺泡萎缩变形，炎细胞浸润，胰腺小叶结构破坏或消失，证实造模成功。而且，CP大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平轻度升高仍在正常范围之内，这与人类CP也极为相似：大多数CP患者血清酶学检查正常，仅在已存在CP的基础上发生急性胰腺炎时，血清淀粉酶和脂肪酶水平可以升高。

　　TGF-β1主要通过TGF-β/Smad信号转导通路发挥生物学效应。TGF-β1必须和其特定细胞膜受体TβRⅡ和TβRI结合，形成Ⅱ型受体-TGF-β1-I型受体三聚体复合物，并进一步激活Smads，使之形成异源二聚体，进入细胞核内与靶基因上特异性的反应元件结合，从而调节相应靶基因的转录，在细胞外基质的沉积和降解中起重要作用。Warrzechaa等[8]用免疫组织化学方法检测到在胰腺腺泡细胞和PSC有TβRⅡ表达，我们的研究首次发现，TGF-β1及TβRⅡ的mRNA在DBTC诱导的CP大鼠的表达水平均较正常大鼠升高，说明在大鼠CP发生时，除了TGF-β1高表达，还可上调其受体TβRⅡ的表达，从而可能将更多的信号刺激转导入细胞核，上调靶基因表达和分泌更多的细胞外基质成分，促进胰腺纤维化。这一研究结果还提示我们，在CP的发生和发展中可能存在TGF-β1/Smad信号转导通路的异常。

　　【参考文献】

　　[1] Vogelmann R， Ruf D， Wagner M， et al. Effects of fibrogenic mediators on the development of pancreatic fibrosis in a TGF-beta1 transgenic mouse model[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280(1)：G164-172.

　　[2] Su SB， Motoo Y， Xie MJ， et al. Expression of transforming growth factor-beta in spontaneous chronic pancreatitis in the WBN/Kob rat[J]. Dig Dis Sci，2000，45(1)：151-159.

　　[3] Sparmann G， Merkord J， Jaschke A， et al. Pancreatic fibrosis in experimental pancreatitis induced by dibutyltin dichloride[J]. Gastroenterology，1997，112(5)：1664-1672.

　　[4] 张俐，袁世珍，徐克强，等. TGF-β1和TβR II在胰腺癌组织中的表达及临床意义[J]. 癌症，1999，18(2)：208-210.

　　[5] 陈启龙，李国威，陈晓，等. 转化生长因子β1在胰腺组织中的表达：慢性胰腺炎发病机制探讨[J]. 中国普通外科杂志，2002，11(10)：612-615.

　　[6] Su SB， Xie MJ， Sawabu N， et al. Suppressive effect of herbal medicine saikokeishito on acinar cell apoptosis in rat spontaneous chronic pancreatitis[J]. Pancreatology，2007，7(1)：28-36.

　　[7] Talukdar R， Tandon RK. Pancreatic stellate cells：new target in the treatment of chronic pancreatitis[J]. J Gastroenterol Hepatol，2008，23(1)：34-41.

　　[8] Warrzechaa Z， Dembinskia A， Ceranowicza P， et al. Immunohistochemical expression of FGF-2， PDGF-A， VEGF and TGFβ RII in the pancreas in the course of ischemia/reperfusion-induced acute pancreatitis[J]. J Physiol and Pharma，2004， 55(4)：791-810.