人乙型肝炎病毒聚合酶在酿酒酵母中的表达

　　作者：于杨,洪性出 作者单位：韩国全州市全北大学校医科大学微生物教研室，韩国 全州市

　　【摘要】 目的 尝试在酵母中表达人乙型肝炎聚合酶蛋白(HBV-Pol)，并用镍基颗粒队蛋白粗提物进行部分纯化。方法 将全长HBV-Pol基因用PCR方法扩增并连接到在酿酒酵母高效表达的质粒中。转化株于30℃培养3 d后进行诱导表达16 h，4℃下收集蛋白粗提物并用镍基颗粒进行提纯。用免疫印迹技术检测表达结果。结果 重组的HBV-Pol存在于该型酵母的蛋白粗提物中，该蛋白产物可被Nickel-particle提取。结论 本研究为实现HBV-Pol在S.c.中的高水平表达提供了可靠依据，也便于HBV-Pol的生化特性研究以及蛋白纯化和抗体制备的进一步开展。

　　【关键词】 乙型肝炎病毒; 聚合酶;酿酒酵母

　　Expression of Human Hepatitis B Virus Polymerase in Saccharomyces CerevisiaeYU Yang, HONG Seong Tchool

　　(Department of Microbiology and Research Center for Industrial Development of Biofood Materials,

　　Chonbuk National University, Medical School, Jeonju 561-756, Republic of Korea)Abstract:Objective Attempt to express HBV-Pol in yeast expression system and then partially purify the rough extract with nickel-based particle. Methods Full length HBV-Pol gene was amplified and was introduced into a high effective expression plasmid of Saccharomyces cerevisiae(S.c.).The transformant was cultured at 30℃ for 3 days, and then induction was carried out for another 16 hours at 30℃, and then induction was carried out for another 16 hours at 30℃. Cell lysis and purification were preformed at 4℃. Target protein was detected in harvested rough extract with western blot. Results The recombinant HBV-Pol was present in rough extract of yeast and could be purified with nickel particle. Conclusions Results of this study prove that HBV-Pol can be expressed in S.c. yeast and might facilitate the biochemical study, protein purification and antibody preparation of HBV-Pol.

　　Key words： hepatitis B virus; polymerase; Saccharomyces cerevisiae

　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是全球性公众健康问题。目前世界上约有3.5 亿乙肝病毒携带者，其中很大比例将会发展成严重的肝脏疾病例如肝硬化、肝细胞癌及其它综合征[1]。

　　乙肝病毒染色体仅有3 200个左右的碱基对，属于hepadnaviridae 家族，有极强的肝细胞靶向性[2]。在乙肝病毒生命周期很重要的一步就是它利用自身编码的逆转录酶进行将其染色体复制。乙肝病毒聚合酶蛋白(HBV polymerase, HBV-Pol)是一种多功能酶，具有蛋白始动活性[3-5]、DNA聚合酶活性、反转录酶活性[6]及RNA酶H活性[7]。它包括了三个结构域，从氨基末端到羰基末端依次是末端蛋白(terminal protein，TP)，聚合酶/逆转录酶(RT)及RNA酶H(RH)。其中末端蛋白与其它两个域间由一空白序列隔开。

　　尽管HBV-Pol在其生命周期中起到至关重要的作用，但是由于HBV-Pol在异源性表达系统中的表达水平低[8]、可溶状态下极不稳定[9]，协同表达的分子伴侣对该酶的潜在影响[10]等原因，关于该酶的生化研究仍然进展缓慢。Kim 等人在协同表达的GRP94的情况下，在大肠杆菌内表达出麦芽糖结合蛋白标记的HBV-Pol，并证明其对乙肝病毒的εRNA有优先结合的特征[11]。Qadri 和Siddiqui[6]在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.C.)表达系统中利用基于Ty1-his3AI 逆转座子构建的质粒表达并得到了部分纯化的HBV-Pol，该HBV-Pol在一种病毒类似颗粒中可以将Ty1 RNA逆转录为DNA。然而稳定的、不需要分子伴侣协同的大规模地在常用异源性表达系统(如大肠杆菌或酵母)中得到完整的HBV-Pol的方法目前仍未见报道。

　　酵母表达系统在重组蛋白表达研究中得到非常广泛的应用，其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.c.)又是最常用的酵母菌株，本研究中，6聚体组氨酸标记的全长HBV-Pol在S.c.中进行表达并用镍基颗粒进行部分纯化。免疫印迹的结果提示在酵母体内表达人HBV-Pol是一种可靠地进行大规模HBV-Pol制备方法，该方法可能会对该蛋白的生化特性研究和纯化，以及特异性抗体的研究提供便利条件。

　　1 材料与方法

　　1.1 酶与试剂

　　pYes2.1topo-His 质粒和V5抗体购买自Invitrogen (US); MagneHis蛋白纯化试剂盒购自 Promega (US); PrimeSTARTM 高保真DNA聚合酶购自TAKARA株式会社 (Japan); T4连接酶及限制性内切酶购自New England Biolabs. DNA质粒纯化试剂盒购自Qiagen (Chatsworth, CA). Saccharomyces cerevisiae(S.c.)菌株(基因型： MATαSUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1)购自ATCC公司。 其它药品均购自Sigma公司。

　　1.2 质粒构建

　　从已经发展成肝细胞癌的慢性乙肝患者部分肝脏切除术后得到少许肝脏组织，切成小块后迅速放入液氮保存。十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)蛋白酶K 消化后采用酚-氯仿提取法得细胞DNA[12]。 HBV-Pol DNA 序列[从第2 307到1623碱基对，共843个氨基酸残基] (GenBank序列号 AF286594) 由PrimeSTARTM 高保真酶进行扩增，引物序列为CPNotIF01: GTT GCG GCC GCA TAA TGG CCC TAT CTT ATC and CPBstBIR01: ATT TTC GAA TTC TCA CGG TGG TTT CCA. pYES2.1topo-His-P 构建方法见图1。于杨，等：人乙型肝炎病毒聚合酶在酿酒酵母中的表达辽宁医学院学报 2008年10月，29(5) 图1 pYES2.1topo-His-P结构如图所示。全长HBV-Pol序列在酶切位点NotI和 BstBI间连入，pYES2.1TOPO-His-P。V5 抗原和多聚赖氨酸尾位于HBV-Pol 3'—末端。质粒表达受控于 Gal 启动子，预计融合蛋白约为96 kD

　　1.3 酵母转化株筛选

　　参照试剂盒说明书将纯化的pYES2.1topo-His-P 质粒转化入感受态酵母。转化株用SC-U (缺少脲嘧啶的最低培养基) 选择性平板培养基 {0.67% 酵母氮基, 2% 碳基, 0.01% (腺嘌呤, 精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸, 色氨酸), 0.005% (天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸) 2%琼脂}进行筛选。

　　1.4 转化株诱导

　　从SC-U平板培养基上挑取一个转化株菌落并接种在含有2%的棉子糖或2%葡萄糖15 mL选择性培养液中(与SC-U plate 成分基本相同，仅缺少脲嘧啶和琼脂)。 30°C于摇床内培养3 d后测定培养液的OD600数值。更换为诱导培养液(与选择性培养液成份基本相同,碳源为2%的半乳糖和2%棉子糖)。将得到的酵母细胞用诱导培养液重悬至OD600=0.4，同样条件下继续培养14～16 h后,1 500 g离心收获细胞待用。斑点杂交(dot bloting)检测诱导效果。

　　1.5 细胞裂解与蛋白纯化

　　酵母细胞用裂解缓冲液悬浮 (50 mM 磷酸钠, pH 7.4; 5% 甘油; 1 mM PMSF)。等体积酸洗玻璃珠加入裂解液中后，混合物在漩涡混匀器上震荡30 s, 紧接着冰上孵育30 s。4 min内将上述步骤重复4 次。总裂解液与MagneHis 镍基颗粒混匀5～10 min。经过MagneHis洗涤缓冲液两次清洗后，用MagneHis洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱。总裂解液、流出液组分及部分纯化组分分别用免疫印迹法(western blot)检测裂解与纯化效果。

　　2 结 果

　　本研究中，HBV-Pol基因由从2307 to 1623 的HBV DNA所编码，具有843个氨基酸残基。表达产物用免疫印迹法(dot blotting 和western blotting)检测。

　　2.1 酵母系统的诱导表达与优化

　　相对于其它微生物，Saccharomyces cerevisiae早已为人熟知的遗传学特性使得它成为最常用于重组蛋白表达的真核细胞表达系统之一。本试验中，重组HBV-Pol的表达遵循了两个策略：一是采用羧基端的6聚组氨酸标记，便于目的蛋白的快速纯化。二是将V5抗原(Gly- Lys- Pro- Ile- Pro- Asn- Pro- Leu -Leu -Gly -Leu -Asp -Ser -Thr)融入羧基端的重组蛋白中，便于采用V5 特异性抗体来检测表达效率。

　　本试验采用了斑点杂交(dot bloting)来确定HBV-Pol表达条件优化。同时也尝试了一些公认较好Saccharomyces cerevisiae诱导优化策略并进行一些改进。首先，用较长的培养时间来代替较短的过夜培养来获得较高的细胞密度;其次，预试结果表明相同容器内(250 mL 锥形烧瓶)较小体积(不大于25 mL)的培养效果要优于同条件下正常体积培养液(50 mL)中的培养;最后，采用较大的容器(500 mL)，其更大的液体表面可以使摇动培养中的细胞获得更多的氧。根据斑点杂交(dot bloting) 的结果, 非转化株的总裂解液中并无目的蛋白存在(图中1)，未诱导转化株的总裂解液中则有一较低的目的蛋白水平存在(图2中2)，提示该营养缺陷型转化株在缺乏脲嘧啶的选择性培养基中生长良好。经过16 h的诱导后，在总裂解液中存在着很高水平的目的蛋白(图2中3)。

　　1 μL的总裂解液点在硝酸纤维素膜上，封闭后用V5抗体识别，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS照相机进行化学荧光检测。1.阴性对照-未转化株总裂解液;2.未诱导转化株总裂解液;3.诱导16 h后的转化株总裂解液

　　2.2 HBV-Pol的纯化

　　由于聚组氨酸标记的蛋白和镍基基质纯化系统快速简便的特点，已被广泛应用于重组蛋白的纯化。本试验中，镍基颗粒替代了传统的柱亲和层析系统来进行目的蛋白的纯化。 根据免疫印迹(western blotting)的结果, 约100 kD的目的蛋白条带分别存在于诱导后转化株的总裂解液(TL)与纯化组分(PF)中。纯化组分中的目的蛋白信号远强于其它各组，在流出液组分(FT)中则没有目的蛋白存在。该结果提示重组的HBV-Pol 能够在酵母表达系统中表达，并很可能在没有协同表达的分子伴侣存在的情况下保持稳定;采用镍基颗粒系统进行纯化效率较高。

　　10 mg的诱导16 h的醇母转化株的总裂解液(TL)，流出液(FT)和纯化后组分(PF)分别用4%～12%的SDS-PAGE进行分离并转移到PVDF膜上，封闭后用V5抗体识别后采用Bio-Rad ChemiDoc XRS照相机进行化学荧光检测。50kD的marker条带处与2抗有交叉活性

　　3 讨 论

　　长期以来关于人HBV-Pol的研究一直存在很多困难，诸如该蛋白难于在异源性系统中表达及在天然状态下纯化等。尽管重组的人HBV-Pol 已经通过很多方式在不同系统里尝试过表达和纯化，纯化出的有活性并可用于生化研究的HBV-Pol仍是难题。

　　人HBV-Pol是一种多功能的蛋白质，在异源性表达系统和在纯化过程中极不稳定[9]。但在本研究中，尽管没有协同表达分子伴侣，仍然有一小部分完整的HBV-Pol 存在于诱导后转化株的总裂解液中。这部分目的蛋白可以通过镍基亲和层析的方法进行纯化。免疫印迹的结果比较提示这种镍基颗粒可能适用于大规模的人HBV-Pol纯化。

　　本研究结果也证明较短的纯化时间是获得完整人HBV-Pol的另一个重要因素。根据之前试验的结果，镍基质柱层析纯化很难得到免疫印迹法可以探测水平的蛋白(数据未出示)。鉴于柱层析的时间较长，步骤繁琐，本试验采用了镍基颗粒的方式来进行纯化。

　　人HBV-Pol对于乙肝病毒的染色体复制至关重要。目前美国FDA通过的6种治疗慢性乙型肝炎的药物中，lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir 和 telbivudine 都是HBV-Pol 的抑制剂[13]。因此对于该蛋白的研究将会有利于更多治疗乙肝药物的研发。

　　根据本试验中的方法，可以在酵母表达系统中进行大规模生产人HBV-Pol的尝试。该重组蛋白的纯化产物将有利于对人HBV-Pol的生化特性的研究，也可能对该蛋白的特异性抗体的制备提供便利。

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