Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定

　　作者：谷燕娇, 高志安，苏荣健 作者单位：1.辽宁医学院附属第一医院病理科;2.辽宁医学院科学实验中心，辽宁 锦州

　　【摘要】 目的 用Grp78基因转染人肝细胞癌SMMC-7721，筛选阳性克隆并鉴定。方法 利用真核表达载体pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721，pcDNA3.1+Grp78与转染试剂的比例(μg/μL)分别为2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8、2∶9， 400 μg/mL G418筛选阳性克隆后，传代扩增，Western Blot鉴定克隆的Grp78表达情况。应用pcDNA3.1空载体作为阴性对照。结果 Western Blot显示，转染后的SMMC-7721经G418筛选，除一个克隆不高表达外，其余克隆均高表达Grp78。结论 Grp78转染SMMC-7721的最佳转染效率是8∶2(转染试剂/DNA)，由于假阳性克隆的存在，筛选后的克隆需要鉴定。

　　【关键词】 Grp78;基因转染;克隆筛选

　　Selecting and Verifying SMMC-7721 Clones Transfected by Grp78 GeneGU Yanjiao1, GAO Zhian1 ,SU Rongjian2

　　(1.The Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University;

　　2.Central Laboratory of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract：Objective This paper is to transfect Grp78 gene to SMMC-7721, select high Grp78 expression clone, and verify. Methods Using pcDNA3.1+Grp78 to transfect human hapatocellular carcinoma SMMC-7721, pcDNA3.1 as control, DNA: Fugene HD (μg/μL) is 2∶3， 2∶4， 2∶5，2∶6，2∶7，2∶8，2∶9 and selecting positive clones by G418(400 μg/mL), amplifying, then verifying them by WB. Results Western Blot indicates that SMMC-7721 transfected by Grp78 gene could high express Grp78. Conclusions The optimized transfection efficiency of Grp78 transfecting SMMC-7721 is 8∶2(Fugene HD/DNA), as the existence of false positive clones, we need to verify all clones before using them.

　　Key words： Grp78; gene transfection; clone selecting

　　Grp78(葡萄糖调节蛋白78)是内质网合成和分泌的一种多功能蛋白质，它是热休克蛋白70家族(HSP70)的一员。在细胞的分化、生存、应激反应、血管的形成、肿瘤的发生等方面都发挥着重要的作用[1-3]。最近研究发现，下调其表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力[4]。为进一步研究Grp78在肝细胞癌侵袭和转移方面的作用，我们用Grp78的真核表达载体转染SMMC-7721，筛选高表达克隆，鉴定。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肝细胞癌SMMC-7721，购至于中科院细胞库。转染试剂 (Fugene HD)和G418购至于沈阳联星。Grp78抗体，购至Santa Cruz。

　　1.2 细胞培养

　　用含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基培养。每3天换1次液，细胞80%融合后传代，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液消化细胞。

　　1.3 人Grp78基因表达载体的构建

　　2007年，已经成功地构建完成[5]。

　　1.4 SMMC-7721细胞G418最小致死剂量筛选

　　用96孔板接种SMMC-7721，细胞密度80%，贴壁24 h后，加入含G418分别为100、200、300、400、500、600、700、800 μg/mL的浓度。每3、4天换液1次，观察时间由细胞的死亡程度决定(一般1个月)。筛选致死SMMC-7721的最少剂量作为以后筛选克隆细胞使用。

　　1.5 pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721

　　选取30代以内的细胞做转染。

　　1.5.1 SMMC-7721接种于6孔板(或平皿)，细胞密度70%左右，每孔2 mL完全培养液(无抗生素);

　　1.5.2 配制转染试剂：按照每孔2 μg DNA/100μL DMEM配制DNA稀释液,加入EP管。分别按照DNA与转染试剂(μg/μL)体积比3∶2,5∶2,8∶2将Fugene HD垂直加入EP管中，混合均匀，室温静置30 min，对照组转染空载体pcDNA 3.1;

　　1.5.3 细胞贴壁24 h后转染，不用更换培养液，直接垂直加入配好的转染试剂(3∶2,4∶2,5∶2,6∶2,7∶2,8∶2,9∶2);

　　谷燕娇，等：Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定辽宁医学院学报 2008年10月，29(5)1.5.4 加入转染试剂后，混合均匀，放入培养箱中培养。

　　1.6 G418筛选

　　24～48 h后，首次换液，加入G418的最小致死剂量。之后每3、4天换液，加G418。注意防止污染。直到形成单个克隆。

　　1.7 克隆培养

　　G418筛选后的克隆细胞，分别挑空载体pcDNA3.1和pcDNA3.1+Grp78至96孔板中，继续加入最小致死剂量的G418培养。标记好克隆的编号，待克隆细胞长满96孔板后，传至24孔板，待其再长满传至6孔板和25 cm2培养瓶中，之后加入半量G418最小致死剂量培养克隆细胞。

　　1.8 克隆鉴定

　　克隆细胞的鉴定，通过WB方法鉴定。分别将转染pcDNA3.1和pcDNA3.1+Grp78的克隆编号后，用细胞刮刀刮下，收集至EP管内。用TBS漂洗后加入RIPA缓冲液(1%NP 40，0.5% 脱氧胆酸钠，1%SDS，0.1%PMSF)裂解细胞，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。加热变性，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5% 脱脂奶粉封闭过夜，加入1∶1 000倍稀释的一抗Grp78，杂交2 h，β-actin作为内参。TBST洗膜后加入二抗温育1 h，TBST洗膜后进行BCIP/NBT显色，采用Chemi-genius凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察

　　每天观察G148不同浓度的SMMC-7721死亡情况，确定400 μg/mL是最佳的浓度。如图1所见，可见转染后的细胞的克隆。

　　2.2 克隆细胞计数1.转染pcDNA3.1+Grp78的克隆;2.转染pcDNA3.1的图片，40倍;3.转染pcDNA3.1+Grp78的克隆，100倍

　　图1 转染后克隆形成图片

　　由表1可见，转染试剂与转染质粒的比例以8∶2最好。表1 克隆形成的个数与HD/转染DNA(μg/μL)之间的关系HD∶DNA3∶24∶25∶26∶27∶28∶29∶2克隆形成数10111620253022

　　2.3 Westren Blot鉴定

　　如图2所示，高表达Grp78细胞克隆的Grp78表达量几乎是SMMC-7721细胞Grp78表达量的三、四倍。由图3可见，转染空载体的克隆细胞与SMMC-7721的Grp78表达情况相近，均比Grp78转染后的克隆表达Grp78水平低。上图为beta-actin结果，下图为7个克隆与SMMC-7721的Grp78表达情况

　　3 讨 论

　　基因转染技术是将纯化的含有靶基因的质粒DNA或RNA送入细胞内，并在细胞内表达。它包括瞬时转染和稳定转染两种。常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞，需要一定的载体和导入方法，用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

　　本试验用pcDNA3.1做载体，转染Grp78基因进入人肝细胞癌SMMC-7721细胞株，48 h后用G418筛选阳性克隆细胞。结果显示，我们选用的pcDNA3.1+Grp78转染效果很好，通过观察形成克隆个数的多少，认为最佳的转染比例为8∶2，即8 μL转染试剂：2 μg DNA。细胞转染的效率的多少与转染试剂和转染DNA的比例有关，一般按照2 μg DNA与转染试剂3、4、5、6、7、8、9μL作为初步试验，如果转染后的克隆数比较少，可以进一步增加转染试剂以得到更多的克隆细胞。转染试剂对细胞是有一定的毒性的，根据细胞的差异而不同。故而，也不是转染试剂越多转染的细胞率越高，比例合适的转染效率才是最好的。

　　鉴定转染基因进入细胞的鉴定，我们应用Western Blot技术(蛋白印迹技术)，因为Grp78转染进入细胞后在蛋白质表达上，理论上会高表达Grp78。转染成功的SMMC-7721一定高表达Grp78蛋白，相反，转染失败的克隆，一定不会高表达Grp78，弃掉。然而，由于在细胞株中，有一些自然抗G418的细胞，在400 μg/mL的G418作用下，这样的细胞也会存留下来，因而，在挑克隆的时候，一定要注意挑单个的克隆，不要混杂周围的不明细胞，确保它们是来自于一个细胞的克隆细胞群。这样在用Western Blot鉴定细胞的时候，就保证了细胞的纯度。当鉴定结果为高表达Grp78的SMMC-7721时，可以认为它们是高表达的，当鉴定结果为非高表达的Grp78的SMMC-7721时，可以认为它们只是具备抗G418特性的克隆，而不是我们需要的阳性克隆。一般筛选细胞克隆都需要筛选10个以上，以备有的克隆株突然丢失了转染的基因片断而影响到下一步的试验。因而，我们需要鉴定并冻存阳性克隆细胞。

　　在以后使用复苏的高表达Grp78的SMMC-7721时，都需要加入半量的G418作为维持剂量，以抑制少量的非高表达Grp78的细胞生长超过高表达Grp78的克隆细胞。

　　综上所述，pcDNA3.1+Grp78转染人肝细胞癌SMMC-7721的最佳的转染比例是8∶2(μL/μg)，获得了高表达Grp78的细胞株。经Western Blot鉴定，除一个克隆未高表达Grp78外，其余克隆均是高表达Grp78克隆。

　　【参考文献】

　　[1] Macro A Arap, Johanna Lahednranta, Paul J Mintz.Cell surface expression of the stress response chaperone GRP78 enables tumor targeting by circulating ligands[J].Cancer Cell，2004，6：275-284.

　　[2] Zhang J, Jiang YX, Li Q.Association of elevated GRP78 expression with increased lymphnode metastasis and poor prognosis inpatients with gastric cancer[J].Clin Exp Metastasis，2006，23：401-410.

　　[3] Langer R, Feith M, Siewert JR.Expression and clinical significance of glucose regulated proteins GRP78 (BiP) and GRP94 (GP96) in human adenocarcinomas of the esophagus[J]. BMC Cancer，2008， 8 ：70.

　　[4] 苏荣健，李贞，程流芳.特异性下调葡萄糖调节蛋白Grp78对肝细胞癌侵袭和转移的影响[J]. 细胞生物学杂志，2007，29(6)：889-894.

　　[5] 吴琼，蔡云鹏，汤海澎，等.人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定 [J].辽宁医学院学报，2007，28(4)20-28.