内皮型一氧化氮合酶基因多态性与宁夏地区缺血性脑血管病的相关性分析

　　作者：周翔鱼,杜彦辉　　作者单位：宁夏医科大学附属医院神经内科，银川 750004

　　【摘要】 目的 研究内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因多态性与宁夏地区人群缺血性脑血管病之间的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)法对宁夏地区596例健康对照者、468例缺血性脑血管病患者的eNOS基因第4内含子可变重复序列多态性(VNTR)进行基因型分析。结果 两组人群eNOS基因第4内含子VNTR表现为eNOS4a/4a，eNOS4a/4b，eNOS4b/4b 3种基因型。在缺血性脑卒中患者中aa基因型频率为2.7%，ab基因型频率为18.7%，bb基因型频率为78.6%;对照组中aa基因型频率为1.2%，ab基因型频率为13.6%，bb基因型频率为85.2%。a等位基因频率在患者组和对照组分别为12.1%和8.0%，经χ2检验，二组间基因型频率a等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=9.122，P=0.010; χ2=10.008，P=0.002)。结论 eNOS4a基因携带与宁夏地区人群缺血性脑血管病的发生有关联性。

　　【关键词】 内皮型一氧化氮合酶,基因多态性,缺血性脑血管病

　　Abstract：Objective To investigate the relation between endothetial nitric oxide synthase(eNOS) gene polymorphism and cerebral ischemic stroke patients of Ningxia. Methods A case-control study was performed to determine whether the variable number of tandem repeats(VNTR) polymorphism of eNOS gene were associated with cerebral ischemic stroke. The VNTR polymorphism of eNOS gene was analyzed with PCR in 468 patients with cerebral ischemic stroke group and 596 healthy subjects group from Ningxia population， Results Involved in this study， VNTR4 of eNOS gene showed 3 genetypes， named eNOS4a， eNOS4b and eNOS4a/4b. The frequencies of the three genetypes were as follows:aa-type 2.7%，ab-type 18.7%，bb- type 78.6% in patient group and aa-type 1.2%，ab-type 13.6%，bb-type 85.2% in control group，stastic difference between two groups was significant (χ2=9.122，P=0.010). The frequencies of eNOS4a in cases was significantly higher than that in controls(χ2=10.008，P=0.002). Conclusion eNOS4a is an genetic factor which is associate with cerebral ischemic stroke of Ningxia population.

　　Key words:endothetia nitric oxide synthase; gene poiymorphism; cerebrovascular disease

　　越来越多的研究表明[1-2]，遗传因素在缺血性脑卒中的发生、发展中起着重要作用，这些基因的缺陷可能是缺血性卒中的危险因素，探讨其遗传背景，对预防和治疗缺血性脑血管病有重要意义。目前已知一氧化氮合酶有三个亚型，分别是神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)，其中由eNOS基因编码所产生的NO是一种自由基性质的气体，具有强烈的舒张血管、松弛血管平滑肌和抑制内皮细胞增殖及特异的神经系统病理生理作用[3]，是最具生物活性的eNOS。该基因第4内含子具有27个碱基数目的可变重复序列多态性(VNTR)，根据重复次数不同表现为eNOS4a/4a、eNOS4b/4b、eNOS4a/4b 3种基因型，研究显示a等位基因较b等位基因具有更重要的病理意义[4]。本研究旨在探讨和进一步证实eNOS基因多态性与宁夏地区缺血性脑血管病的相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　本研究共纳入缺血性脑血管病患者共468例，其中血栓性脑梗死404例，腔隙性脑梗死33例，短暂性脑缺血发作 21例; 男338例，女130例，平均年龄59.43岁。病例组来自宁夏医科大学附属医院神经内科2007年1月至2008年7月缺血性脑血管病住院患者，经详细神经系统检查及CT、MRI证实，诊断符合1995年中华医学会第4届脑血管会议修订的缺血性脑血管病诊断标准，并除外栓塞、低血容量、感染、肿瘤等所致的脑梗死。对照组596例，选择同期在宁夏医科大学附属医院门诊和体检中心进行常规健康体检的人群，其中男489例，女107例，平均年龄43.96岁。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　Promega公司全血DNA提取试剂盒;北京天根生物工程公司提供预混式PCR反应体系试剂，标准分子量 marker，上、下游引物并进行PCR反应产物测序。引物设计为：上游：5’-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3’，下游：5’—TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3’。高速离心机、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪、紫外光成像设备等均由宁夏医科大学中心实验室提供。

　　1.3 方法

　　1.3.1 DNA提取与纯化

　　所有研究对象均抽取清晨空腹外周静脉血3mL，EDTA抗凝后储存于-80℃冰箱备用。严格按照promega公司全血DNA提取试剂盒说明书，取全血300μL提取并纯化DNA，-20℃保存备用。

　　1.3.2 聚合酶链反应

　　反应体系50μL，组成为：模板DNA 2μL，预混式PCR反应体系25μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 19μL。反应条件：94℃ 2 min，94℃ 45 s，59℃ 1 min，72℃ 1 min，终末72℃延伸5 min，共35个循环。

　　1.3.3 基因型判定

　　反应结束后，取PCR产物6μL于2%琼脂糖凝胶中电泳，电压80V，45 min后取出凝胶在紫外灯下判定基因型。

　　1.3.4 序列测定及分析

　　将部分判定为纯合子基因型的PCR产物经回收纯化后送北京天根生物公司测序，并根据重复序列数目证实基因型的正确性。

　　1.4 统计学方法

　　所有实验数据采用SPSS 11.5统计软件建立数据库，基因频率采用计数法，各组间基因型频率和等位基因频率的差异显著性用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PCR反应产物凝胶电泳图(图1，见封4)

　　aa基因型为393bp大小条带，bb基因型为420bp大小的条带，ab基因型为含393bp和410bp条带。

　　2.2 PCR反应产物测序图

　　4次27bp重复序列，证实为aa基因型(图2，见封4)。5次27bp重复序列为bb基因型。

　　2.3 观察组和对照组eNOS基因型及等位基因频率分布(表1)。

　　表1显示，两组对象eNOS基因型及等位基因频率间差异有统计学意义(P=0.010，P=0.002)。表1 各观察组eNOS基因型及等位基因频率分布(略)

　　3 讨论

　　缺血性脑血管病是一种多因素参与的疾病，很多基因和环境因素共同起作用，遗传因素在缺血性脑卒中的发生、发展中起着重要作用。探讨易感基因的遗传背景及其作用方式，对预防和治疗缺血性脑血管病有重要意义。

　　eNOs基因在人类染色体上定位于7q35-36区，跨度约21Kb，含有26个外显子和25个内含子，相应的信使核糖核酸约4.1 Kb，翻译生成含1203个氨基酸的蛋白产物。eNOS基因在单倍体人类基因组中以单拷贝基因形式存在，eNOS基因DNA串联重复序列多态性和单核苷酸多态性超过15种，分别位于5’端的1474，924，786，691，编码区的774，894，以及内含子2，4，8，11，12，13，18，22和23。己有研究认为，eNOS基因多态性是影响NO合成的重要因素，与多种疾病相关联[4]。由于 eNOS 基因的多态性可影响 eNOS 的表达与功能，导致 eNOS 活性改变 ，而eNOS 是 NO 合成的关键酶 ，其活性变化直接调节 NO 的生成量及其生物学效应。因而可以说 ，eNOS基因的作用最终可能是通过 NO 效应来完成的。在脑卒中脑缺血时，NO含量变化对继发性脑水肿与脑梗死的病理生理过程起重要作用。脑缺血早期由eNOS介导的NO增多可扩张血管，抑制血小板黏附和聚集，对抗缺血性脑损伤而起保护作用。中晚期则可因iNOS诱导过量的NO而导致神经细胞死亡[5]。

　　NO又称内皮舒张因子，是一种不呈Ca2+依赖性胞裂外排式释放，而以弥散方式透过细胞膜到达靶细胞的生物活性物质。其主要作用包括：扩张血管、调节血压;增加血管壁通透性，抑制血小板聚集;维持脑血管舒张和自动调节;调节突触传递功能，参与突触可塑性构建、痛觉调制;并可介导GLU的神经毒性作用。

　　本研究检测的人群中发现了2种等位基因a、b和3种基因型bb、ab、aa(图1)。4次27bp重复序列为aa基因型(图2见封4)，5次27bp重复序列为bb基因型。eNOS基因的VNTR在缺血性脑血管病患者中aa基因型频率为2.3%，ab基因型频率18.4%，bb基因型频率为79.3%，对照组中aa基因型频率为0.95%，ab基因型频率为13.57%，bb基因型频率为85.48%。a等位基因频率在患者组和对照组分别为12.1%、8%，经χ2检验，两组间的各种基因型频率及等位基因频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。显示脑梗死组 eNOS4a 携带者明显多于对照组，说明eNOS VNTR4与宁夏地区人群缺血性脑卒中发病有关联，携带a等位基因的基因型发生缺血性脑卒中的危险性增加。

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