去甲肾上腺素对胰腺癌细胞株MiaPaCa2侵袭能力的影响

　　作者：郭坤，沙焕臣，马清涌，王连才，胡恒通 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 探讨经典神经递质去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)对人胰腺癌细胞株MiaPaCa2侵袭能力的影响及其作用机制。方法 取人胰腺癌细胞株MiaPaCa2为研究对象，实验分为空白对照组、0.1μmol/L NE干预组、1μmol/L NE干预组和10μmol/L NE干预组。干预48h后，采用Transwell侵袭实验检测各组中MiaPaCa2细胞侵袭能力的变化;RTPCR法检测细胞中MMP2、MMP9和VEGF mRNA的表达;免疫细胞化学法检测细胞中MMP2、MMP9和VEGF蛋白的表达。结果 1μmol/L NE干预组和10μmol/L NE干预组MiaPaCa2细胞的侵袭能力均高于空白对照组(P<0.01);1μmol/L NE干预组和10μmol/L NE干预组MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9和VEGF mRNA和蛋白表达水平均高于空白对照组(P<0.05)。结论 NE可以通过上调MMP2、MMP9和VEGF的表达从而促进胰腺癌细胞发生远处侵袭转移。

　　【关键词】 胰腺癌;细胞侵袭;神经递质;去甲肾上腺素

　　Effect of norepinephrine on the invasiveness of

　　pancreatic cancer cell line MiaPaCa2GUO Kun, SHA Huanchen, MA Qingyong, WANG Liancai, HU Hengtong

　　(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effect of norepinephrine (NE) on the invasiveness of pancreatic cancer cell line MiaPaCa2 and its action mechanism. Methods The pancreatic cancer cell line MiaPaCa2 was used in the research. The cells were randomly divided into control group, 0.1μmol/L NE intervention group, 1μmol/L NE intervention group and 10μmol/L NE intervention group. After intervention for 48h, Transwell invasiveness test was given to examine the changes of invasive ability of MiaPaCa2. The expressions of MMP2 mRNA, MMP9 mRNA and VEGF mRNA were measured by semiquantitative RTPCR; the levels of MMP2, MMP9 and VEGF proteins were measured by immunocytochemical method. Results The invasive ability of MiaPaCa2 in 1μmol/L NE intervention group and 10μmol/L NE intervention group was significantly higher than that in control group (P<0.01). The levels of MMP2, MMP9 and VEGF mRNA and protein expression of MiaPaCa2 in 1μmol/L NE intervention group and 10μmol/L NE intervention group were higher than those in control group (P<0.05). Conclusion NE can promote the invasiveness of MiaPaCa2 through upregulating the expressions of MMP2, MMP9 and VEGF.

　　KEY WORDS: pancreatic cancer; cell invasiveness; neurotransmitter; norepinephrine

　　胰腺癌具有侵袭力强、早期即发生转移的特点，5年生存率不足5%，其主要原因是患者在就诊时肿瘤就已经发生了远处转移。肿瘤细胞侵袭能力增强是肿瘤远处转移的先决条件。所以，研究胰腺癌细胞侵袭能力的影响因素对指导临床诊治有重要意义。近年来，肿瘤细胞微环境中的信号物质对肿瘤细胞侵袭能力的影响成为研究的热点，这些信号物质包括趋化因子和神经递质两类[1]。本研究旨在通过观察胰腺癌细胞株MiaPaCa2在不同浓度经典神经递质去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)的干预下侵袭能力的变化，以及细胞中MMP2、MMP9、VEGF mRNA和蛋白表达的变化，探讨NE对胰腺癌细胞侵袭能力的影响及其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 胰腺癌细胞株MiaPaCa2由西安交通大学医学院中心实验室提供;高糖DMEM培养基及小牛血清购自Gibco公司;去甲肾上腺素购自Sigma公司;兔抗人MMP2、MMP9、VEGF多克隆抗体购自北京博奥森公司;免疫组化SP试剂盒及DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司;总RNA提取试剂盒(RNAfast200)购自上海飞捷生物技术公司;逆转录试剂盒购自MBI公司;PCR试剂盒购自TaKaRa公司;引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;Millicell小室购自美国Millipore公司;Matrigel基质胶及MTS试剂盒购自BD公司;PCR扩增仪为Gene公司产品。

　　1.2 细胞培养与实验分组 MiaPaCa2细胞用含100mL/L小牛血清的高糖DMEM培养基在37℃，50mL/L CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞，经胰酶消化后制成细胞密度为5×105/mL的细胞悬液，将其接种于细胞培养板，待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入NE浓度为0、0.1、1、10μmol/L的高糖DMEM培养基，实验分为空白对照组、0.1、1、10μmol/L NE组，干预48h后用于随后实验。每孔设3个复孔，实验重复3次。

　　1.3 Transwell法检测细胞体外侵袭能力 将Millicell小室放入24孔板中，4℃溶解Matrigel基质过夜，稀释后加100μL于上室，37℃孵育4h使Matrigel基质凝固，下室加入600μL含100mL/L小牛血清的DMEM培养基。经去甲肾上腺素干预后的MiaPaCa2细胞，经胰酶消化后用无血清培养基制成1×105/mL细胞悬液，取200μL细胞悬液种入上室[2]。在37℃、50mL/L CO2的培养箱中孵育24h后，用棉签轻轻拭去滤膜上表面未穿透的细胞，利用MTS法检测穿膜细胞数，严格按照试剂盒说明书进行检测。移出小室，倒置风干，24孔板中加入500μL(1g/L)结晶紫，将小室置入结晶紫37℃孵育30min后取出，PBS冲洗3次，每次5min。各选择5个高倍镜(10×20)视野照相。每组设3个复孔，实验重复3次。

　　1.4 胰腺癌细胞RNA的提取及RTPCR 经去甲肾上腺素干预后的MiaPaCa2细胞用RNAfast200试剂盒提取细胞中的总RNA。取RNA 5μL，用RT试剂盒合成cDNA链，再以逆转录反应液3μL作为模板，用25μL反应体系，加入PCR Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH2O 7.5μL，用PCR试剂盒进行扩增。MMP2引物序列为：上游5′CCGTCGCCCATCATCAAGTTC3′，下游5′GCAGCCATAGAAGGTGTTCAGG3′;MMP9引物序列为：上游5′TGGTCCTGGTGCTCCTGGTG3′，下游5′GCTGCCTGTCGGTGAGATTGG3′;VEGF引物序列为：上游5′CTGGGCTGTTCTCGCTTCG3′，下游5′CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC3′;内参照βactin引物序列为：上游5′ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG3′，下游5′AGGAAGGAAGGCTGGAAG

　　AGTG3′。PCR反应条件为：变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共35个循环，72℃延伸5min终止反应。扩增产物用2g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影。应用Chemi Image 5500自动电泳凝胶成像分析仪测定目标产物与βactin扩增带平均灰度值(A)，计算目标产物mRNA表达指数(I)，I=A产物/Aβactin。

　　1.5 免疫细胞化学法测定MMP2、MMP9及VEGF蛋白表达 6孔细胞培养板每孔放置8mm×8mm盖玻片4个，每孔加入5×105/mL的细胞悬液3mL，待细胞贴壁后，用含不同浓度NE的高糖DMEM培养基干预48h，制成细胞爬片。用SP法对爬片进行染色，严格按照试剂盒说明书进行检测。一抗滴度为1∶200，PBS代替一抗做阴性对照。中性树胶封片后于光镜下观察照相，免疫组化结果用彩色图像分析软件Image Pro Plus进行灰度测量。

　　1.6 统计学分析 数据结果用±s表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行分析，不同组之间应用单因素方差分析进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 NE对MiaPaCa2细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验结果显示(图1、图2)，随NE浓度增大，MiaPaCa2细胞穿膜细胞数量逐渐增多。与空白对照组相比，1μmol/L和10μmol/L NE处理组穿膜细胞数量明显增多，差异有统计学意义(P<0.01);0.1μmol/L NE处理组与空白对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达的变化 RTPCR及半定量分析显示(图1、表1)，1、10μmol/L NE处理组MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达均高于空白对照组(P<0.05)，0.1μmol/L NE处理组与空白对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。且MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达与NE浓度呈剂量依赖性。

　　2.3 MMP2、MMP9及VEGF蛋白表达的变化 MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9及VEGF的灰度值随NE浓度的增大而降低，表明蛋白的表达量在升高(表2、图4)。与空白对照组相比，1、10μmol/L NE处理组MMP2、MMP9及VEGF表达均有显著性差异(P<0.05);0.1μmol/L NE处理组与空白对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。表1 MiaPaCa2细胞的MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达表2 不同浓度NE组MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9和VEGF蛋白表达灰度值

　　3 讨 论

　　90%的肿瘤病人不是死于原发病灶，而是死于肿瘤的远处转移。肿瘤远处转移的发生目前有两种理论，一种是基于基因突变的理论，它由FEARON和VOGELSTEIN在结肠癌中提出[3]，并随着肿瘤抑制基因MADH4的发现而得到了发展;另一种理论是基于信号物质的发现，比如和G蛋白偶联受体结合的配体物质，研究发现，这些信号物质能够调节肿瘤细胞的主动迁移和侵袭能力。这些配体物质重要包括两类：趋化因子和神经递质[2]。NE是一种经典的神经递质，研究发现，NE能够促进肿瘤细胞的主动迁移和侵袭能力。SOOD等[4]研究发现，NE能够促进卵巢癌细胞的侵袭转移;LANG等[5]在乳腺癌和前列腺癌中也证实了NE能够促进肿瘤细胞侵袭转移的现象。本研究显示：随着NE干预浓度的增加，胰腺癌细胞的侵袭能力逐渐增强，表明NE参与直接调节胰腺癌细胞的侵袭能力，促进胰腺癌细胞的远处转移。

　　肿瘤细胞侵袭转移的发生，包括粘附基底膜、细胞外基质的溶解、主动迁移和穿过基底膜的过程，其中，肿瘤细胞溶解细胞外基质的能力在肿瘤的侵袭转移中发挥了重要的作用，而间质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是这一过程的关键因子。MMPs可以降解细胞外基质中的胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖类蛋白，从而进一步有利于肿瘤细胞的远处转移。研究发现，MMPs和VEGF在人类多种肿瘤中发生共表达。BELOTTI等[6]发现高水平的VEGF和MMPs在卵巢癌病人中共表达;MUNAUT等[7]发现在胶质母细胞瘤中VEGF的表达与MT1MMP、MMP2和MMP9表达呈正相关;DONY等[8]在人头颈鳞状细胞癌中也发现MMP9与VEGF的表达呈正相关。本研究显示：NE能够调节胰腺癌细胞中MMP2、MMP9和VEGF的表达，呈浓度依赖性。NE上调MMP2、MMP9和VEGF的表达导致了胰腺癌细胞侵袭能力的增强。

　　我们的研究证实，NE在胰腺癌侵袭转移的发生和发展过程中具有重要作用。NE能够在mRNA和蛋白水平上调胰腺癌细胞中MMP2、MMP9和VEGF的表达，从而进一步促进胰腺癌细胞发生远处侵袭转移。总之，对肿瘤细胞微环境中信号物质的研究对于明确肿瘤发生远处侵袭转移机制具有重要意义，在这一领域仍然需要进行深入的研究。

　　【参考文献】

　　[1]ENTSCHLADEN F, DRELL TL, LANG K, et al. Tumourcell migration, invasion, and metastasis:navigation by neurotransmitters [J]. Lancet Oncol, 2004, 5(2):254258.

　　[2]杜岳峰，邢毅飞，曾甫清，等. 逆转录病毒介导CXCR4siRNA对前列腺癌细胞体外侵袭能力的影响 [J]. 西安交通大学学报：医学版, 2006, 27(5):426432.

　　[3]FEARON ER, VOGELSTEIN B. A genetic model for colorectal tumorigenesis [J]. Cell, 1990, 61(8):759767.

　　[4]SOOD AK, BHATTY R, KAMAT AA, et al. Stress hormonemediated invasion of ovarian cancer cells [J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(4):369375.

　　[5]LANG K, DRELL TL, LINDECKE A, et al. Induction of a metastatogenic tumor cell type by neurotransmitters and its pharmacological inhibition by established drugs [J]. Int J Cancer, 2004, 112(9):231238.

　　[6]BELOTTI D, PAGANONI P, MANENTI L, et al. Matrix metalloproteinases (MMP9 and MMP2) induce the release of vascular endothelial growth factor (VEGF) by ovarian carcinoma cells:implications for ascites formation [J]. Cancer Res, 2003, 63(4):52245229.

　　[7]MUNAUT C, NOEL A, HOUGRAND O, et al. Vascular endothelial growth factor expression correlates with matrix metalloproteinases MT1MMP, MMP2 and MMP9 in human glioblastomas [J]. Int J Cancer, 2003, 106(3):848855.

　　[8]DO NY, LIM SC, IM TS. Expression of cerbB receptors, MMPs and VEGF in squamous cell carcinoma of the head and neck [J]. Oncol Rep, 2004, 12(8):229237.