Angiostatin基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

　　作者：董典宁　孙平 智绪亭 孙学英 寿楠海

　　【摘要】目的：研究Angiostatin基因治疗对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相关机理。方法：使用人原发性肝癌细胞株SMMC7721建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型，质粒用脂质体DOTAP介导转染细胞。将荷瘤裸鼠随机分为两组，分别注射质粒PcDNA3、Angiostatin/PcDNA3，观察两组动物的肿瘤生长曲线，检测肿瘤的Angiostatin、VEGF、HIF1α表达和微血管密度(MVD)，利用TUNEL染色法行原位细胞凋亡分析。结果：Angiostatin基因治疗在早期具有抑制肿瘤生长的作用，大约1周后肿瘤以更快的速度生长并迅速赶上空质粒对照组肿瘤;Angiostatin基因治疗组的肿瘤组织中有Angiostatin的局部高表达，MVD(24.8±2.8)低于空质粒对照组(30.2±4.1)(P0.05)。肿瘤组织中HIF1α蛋白局部高表达，VEGF表达高于空质粒对照组，细胞凋亡指数(2.87±0.48)高于空质粒对照组(1.55±0.43)(P0.01)。结论：Angiostatin基因治疗对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有一定的抑制作用，肿瘤对Angiostatin基因治疗可以产生耐受性。

　　【关键词】基因，Angiostatin?血管内皮细胞生长因子?缺氧诱导因子?基因疗法?肝肿瘤?小鼠，近交BALB C

　　Experimental study on the effect of angiostatin on implanted human primary hepatic carcinoma in nude mouse

　　DONG Dianning1,SUN Ping,ZHI Xuting,SUN Xueying,SHOU Nanhai

　　Department of General Surgery,Shandong Provincial Hospital(Jinan 250021,China)

　　Department of Obstetrics and Gynecology,3Department of General Surgery，Qilu Hos

　　pital of Shandong University(Jinan 250012,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To observe the effects of angiostatin gene on implanted human primary hepatic carcinoma in nude mouse.Methods:Tumors were established by injection of 3×106 tumor cells named SMMC7721 into the back of nude mice.The mice were classified randomly into two groups,injected respectively with vacant plasmid PcDNA3,angiostatin plasmid.Half of the nude mice were used to observe the tumor growth curve,the other half to obtain the tumor samples.The tumor samples were prepared in the 4th day after gene transfer to be used in the examinations ofthe expression of angiostatin,HIF1α and VEGF with immunohistochemistry and Western blot analysis,of MVD in the tumor with immunohistochemistry,and of cell apoptosis with TUNEL staining.Results:Tumor grew rapidly in the control group,whereas,in the angiostatin group,tumors were suppressed for one week after gene transfer,then they grew even faster and caught up with control group tumors.Immunohistochemistry analysis and Western blot analysis of tumor tissue revealed angiostatin gene therapy resulted in overexpression of angiostatin in situ.In addition,the expression of VEGF in the angiostatin group is a little higher than that in the control group.AI in the angiostatin group is higher than that in the control group(P0.01),concurrently MVD is lower(P0.05).Conclusion:The angiostatin gene therapy can inhibit the tumor growth in some degree,but the tumor can obtain resistance to angiostatin gene therapy by hypoxia inducible factor.

　　【KEY WORDS】Genes,Angiostatin?Vascular endothelial growth factor?HIF?Gene therapy?Liver neoplasms?Mice inbred BALB C

　　1971年Folkman[1]首先提出用抑制肿瘤血管生成的方法治疗肿瘤，因为导致肿瘤血管形成、发展的原因是局部血管生成促进因子和抑制因子之间的平衡被打破，即血管生成刺激因子增多和(或)血管生成抑制因子减少。血管生成促进因子中以Angiostatin的作用较为突出，在体外可抑制血管内皮细胞的增殖，在体内通过抑制肿瘤血管的生成而显著抑制肿瘤的生长及转移[2~5]。但由于该因子有效剂量大，长期用药存在许多问题，因此其基因治疗更具有重要意义。

　　1 材料和方法

　　1.1　材料BALB/C裸小鼠24只，雌雄各半，4~5周龄，体重18~20g，购自中国科学院上海实验动物中心。人原发性肝癌细胞系SMMC7721购于中国科学院上海细胞生物学研究所。质料pcDNA3、Angiostatin/pcDNA3由新西兰奥克兰大学孙学英博士惠赠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 真核表达质粒用分子生物学的方法扩增，酶切鉴定，测序证实无误。

　　1.2.2 细胞培养人原发性肝癌细胞系SMMC7721用含有10%小牛血清的1640培养基在37℃、5%CO2条件下培养。细胞生长至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS制成细胞悬液，调整细胞密度至3×107/ml，用于建立动物模型。

　　1.2.3 动物模型的建立及分组每只裸鼠背部取一点皮下种植细胞悬液0.1ml。待裸鼠肿瘤生长至0.4时，荷瘤裸鼠随机分为两组，分别为PcDNA3对照组、Angiostatin/PcDNA3治疗组，每组12只裸鼠，其中6只观察肿瘤生长曲线，另外6只切取肿瘤标本供实验室检查用。

　　1.3 肿瘤基因治疗及观察指标

　　1.3.1 肿瘤基因治疗目的基因在阳离子脂质体DOTAP的介导下转染细胞。基因转染液直接瘤体内多点注射。基因转染液配方[6]：总体积为100μl，其中纯化的真核表达质粒50μl(浓度约为2mg/ml)，DOTAP40μl，50%葡萄糖10μl，1%Triton X1001μl。对照组与治疗组分别注射pcDNA3、Angiostatin/pcDNA3。

　　1.3.2 肿瘤生长曲线

　　注射药物后，每天观察肿瘤生存状态，每3天用游标卡尺测量肿瘤长、短径，计算肿瘤的体积，绘制皮下肿瘤生长曲线。肿瘤体积=π/6×(长径×短径2)[7]，π值取3.14。

　　1.3.3免疫组化结果判定采用SABC法,注射药物后4d切除标本，检测两组中Angiostatin、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、HIF1α(缺氧诱导因子1α)表达情况。结合病理图像分析系统，由两名病理科医师采用盲法阅片的方式，进行结果评价。评价标准[8]：随机选择5个高倍镜视野(400倍)进行判断，细胞浆着色成棕黄色为阳性表现，Angiostatin、VEGF、HIF1α的表达以染色强度和阳性细胞率的得分之和进行判断：无染色0分，弱染色(浅黄色)1分，中等染色(棕黄色)2分，强染色(黄褐色)3分;阳性细胞率5%0分，5%~25%1分，26%~50%2分，50%3分。上述两项得分相加，0分为阴性(-)，1~2分为弱阳性(+)，3~4分为中等阳性(++)，5~6分为强阳性(+++)。见表1~3。表1 两组肿瘤标本中Angiostatin表达的结果(略)表2　两组肿瘤标本中HIF1α表达结果(略)表3 两组肿瘤标本中VEGF表达结果(略)

　　用CD31抗体和MEC13.3标记微血管，检测微血管密度(MVD)[9]。

　　1.3.4　蛋白质印迹(western blot)检测Angiostatin和VEGF在肿瘤标本中的表达。

　　1.4 统计学分析采用SPSS11.5统计分析软件进行数据处理。免疫组化的统计分析采用x2检验，其它实验数据以x±s表示，采用t检验。P0.05具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肿瘤生长曲线见图1(略)。Angiostatin基因治疗组的肿瘤生长早期受到一定程度的抑制，第6天肿瘤体积小于对照组(P0.05)，约1周后，以更快的速度生长并且很快赶上对照组。

　　2.2　免疫组织化学结果治疗组的Angiostatin、HIF1α、VEGF表达均高于对照组(P0.01,P0.05,P0.05)。见图2(略)，表1~3。

　　2.3 蛋白质印迹(western blot)治疗组中Angiostatin的表达明显高于对照组。两组HIF1α均有较高的表达，治疗组HIF1α和VEFG表达高于对照组(P0.05)。见图2，表1~3。

　　2.4 微血管密度见图3(略)。治疗组肿瘤的MVD明显低于对照组(24.8±2.8 VS 30.2±4.1,P0.05)。

　　2.5 细胞凋亡指数见图3。治疗组AI明显高于对照组(2.87±0.48 VS 1.55±0.43,P0.01)。

　　3 讨论

　　抗肿瘤药物耐药性是导致抗肿瘤治疗失败的一个主要原因。药物可以暂时抑制肿瘤生长，但是肿瘤细胞会一直释放各种“生存因子”(surviving factors)从而获得耐药性，这是由肿瘤细胞基因组的不稳定性决定的。血管生成抑制剂是一种新型抗肿瘤药物，因为它们的作用靶点是机体基因稳定的正常血管内皮细胞，一直以来被认为能够避免或者明显延迟耐药性的产生[10]。许多抗血管生成药物治疗恶性肿瘤的临床前期研究结果提示它可避免耐药性的产生，而且在治疗某些非恶性肿瘤的临床研究中也有类似结果。然而，也有一些研究结果提示，肿瘤对抗血管生成药物也可逐渐失去反应即获得耐药性，尤其单独给药时明显[11]。近来，Yu等[12]报道，抑癌基因P53的状态决定了肿瘤对抗血管生成治疗的反应，提示肿瘤细胞的基因不稳定性是肿瘤对抗血管生成治疗产生耐药性的主要原因。

　　大量的研究表明，恶性肿瘤的进展、转移、预后以及对放化疗的第三性均与肿瘤的缺氧状态密切相关，肿瘤的缺氧状态在新生血管形成中起着关键作用。本实验结果显示：应用Angiostatin基因治疗人肝癌裸鼠皮下瘤时，可以在一定程度上抑制肿瘤生长，降低微血管密度，诱导细胞凋亡。同时肿瘤的缺氧状态激活了HIF1，从而促进VEGF的转录，促进肿瘤血管形成和细胞能量代谢，使肿瘤细胞对药物治疗产生了耐药性。HIF1是细胞在缺氧条件产生的核蛋白，是连接靶基因的缺氧反应元件(HREs)，可促进VEGF以及糖分解相关蛋白质(如Glut1、Glut3)等编码基因的转录，增强肿瘤的生存能力。越来越多的资料显示，缺氧和HIF在肿瘤新生血管形成中起着重要的调节作用。

　　本研究提出，除了肿瘤细胞的基因不稳定性之外，肿瘤尚可通过激活缺氧适应途径对抗血管生成治疗产生耐药性。本研究中Angiostatin基因治疗不能完全抑制肿瘤生长的原因除了上述两点之外，药物剂量以及给药方式也可能是影响因素之一，相关问题有待进一步研究。恶性肿瘤在生长过程中，由于组织增生过快必然会造成局部组织严重缺氧，从而激活HIF1，引起肿瘤组织对缺氧的适应，促进血管生成，维持肿瘤细胞能量代谢，从而促进肿瘤增殖和转移。应用Angiostatin基因抑制肿瘤血管生成的同时，用反义HIF1α基因阻断肿瘤组织的缺氧适应途径可能会产生更好的治疗效果。因此HIF将成为一个新的抗血管生成基因治疗的作用靶点，相关问题有待进一步的试验研究。

　　参 考 文 献

　　[1]Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implication[J].N Engl J Med,1971,285(21):11821186.

　　[2]Sim BK，O’Reilly MS，Liang H,et al.A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer[J].Cancer Res,1997,57(7):13291334.

　　[3]Lannutti BJ,Gately ST,Quevedo ME,et al.Human angiostatin inhibits murine hemangioendothelioma tumor growth in vivo[J].Cancer Res,1997,57(23):52775280.

　　[4]Kirsch M,Strasser J，Allende R,et al.Angiostatin suppresses malignant glioma growth in vivo[J].Cancer Res,1998,58(20):46544659.

　　[5]吴清，孙启龙，丁印鲁，等.TNP470对胃癌细胞株SGC7901体外血管生成拟态的抑制作用[J].中国现代普通外科进展，2005，8(4)：222.

　　[6]Sun X,Kanwar JR,Leung E,et al.Angiostatin enhances B7.1mediated cancer immunotherapy independently of effects on vascular endothelial growth factor expression[J].Cancer Gene Ther,2001,8(10):719727.

　　[7]Hanahan D,Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis[J].Cell,1996,86(3):353364.

　　[8]Gohji K,Katsuoka Y,Okamoto M,et al.Human heparanase:roles in invasion and metastasis of cancer[J].Hinyokika Kiyo,2000,46(10):757762.

　　[9]Araya M,Terashima M,Takagane A,et al.Microvessel count predicts metastasis and prognosis in patients with gastric cancer[J].Surg Oncol,1997,65(4):232236.

　　[10]Folkman J,Hahnfeldt P,Hlatky L.Cancer:looking outside the genome[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2000,1(1):7679.

　　[11]Kerbel RS,Yu J,Tran J,et al.Possible mechanisms of acquired resistance to antiangiogenic drugs:implications for the use of combination therapy approaches[J].Cancer Metastasis Rev,2001,20(12):7986.

　　[12]Yu JL,Rak JW,Coomber BL,et al.Effect of p53 status on tumor response to antiangiogenic therapy[J].Science,2002,295(5559):15261528.

　　[ 通讯作者]智绪亭，Tel:13791122936 Email:zhixuting@hotmail.com

　　董典宁，等.Angiostatin基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

　　1山东省立医院血管外科(山东济南 250021)山东大学

　　2齐鲁医院妇产科

　　3齐鲁医院普外科肝胆血管外科研究所(山东济南250012)