γ干扰素对HBV相关性肝癌细胞凋亡的免疫调节效应研究
发表时间：2010-04-23 浏览次数：471次
作者：韩丽辉 孙汶生 贾晓青 马春红 高立芬 刘素侠 王晓燕
【摘要】目的：以转染HBV全基因组并稳定分泌病毒抗原的HepG2.2.15肝癌细胞系为细胞模型,探索IFNγ对HBV相关性肝癌的免疫调节效应。方法：用HBsAg 和HBeAg ELISA检测试剂盒测定IFNγ作用0，6，12，24h后，HBV病毒颗粒的分泌表达水平。通过MTT法检测不同剂量IFNγ对新型凋亡配体TRAIL与TWEAK的生长抑制效应的调节作用,不同剂量IFNγ对TRAIL与TWEAK的凋亡诱导效应的调节作用。结果：IFNγ在不同的时间点对HBsAg和HBeAg的分泌均具有抑制作用，IFNγ能够显著增强TRAIL和TWEAK对HepG2.2.15肝癌细胞系的生长抑制效应和凋亡率。讨论：IFNγ是HBV感染后的一个重要的免疫效应分子，它可以通过抑制病毒复制和增强免疫监视分子的效应而在HBV相关性肝癌中发挥抗病毒和抗肿瘤效应。
【关键词】干扰素γ，重组?肝肿瘤?肝炎病毒，乙型?配体?细胞凋亡?免疫，细胞
Immune regulation effect of IFNγ on HBV related hepatocarcinoma
HAN Lihui,SUN Wensheng,JIA Xiaoqing,MA Chunhong,GAO Lifen,LIU Suxia,WANG Xiaoyan
Immunology Institute of Medical School,Shandong University (Jinan 250012,China)
【ABSTRACT】Objective:The HBV transgenic HepG2.2.15 hepatocarcinoma cell line was used as a cell model to explore the immune regulation effect of IFNγ on the HBV related hepatocarcinoma.Methods:The HBV particles secreted by HepG2.2.15 cells were detected by HBsAg and HBeAg detecting ELISA kits.Modulation of IFNγ to the the growth inhibiton effect induced by apoptosis inducing ligand TRAIL and TWEAK were assayed by MTT method.Modulation of IFNγ to the apoptosis inducing effect of TRAIL and TWEAK were assayed by flow cytometry.Results: Secretion of HBsAg and HBeAg could be inhibited by IFNγ.The growth inhibition effect and apoptosis induced by TRAIL and TWEAK could be greatly increased by IFNγ.Conclusion:IFNγ is a very important immune effective molecule that will play a key role after HBV infection.It could exert its immune function by inhibiting the virus secretion and enhance the immune surveillance in HBV related hepatocarcinoma.
【KEY WORDS】Interferongamma,recombinant?Liver neoplasms?Hepatitis B virus?Ligands?Apoptosis? Immunity,cellular
HBV的感染将引发机体较强的免疫反应，免疫反应是否适度，其效应如何等问题，将直接影响着HBV感染者的预后。IFNγ是HBV引发机体细胞免疫的一个重要的细胞因子，研究IFNγ对HBV感染的肿瘤细胞的免疫效应，对于阐明HBV感染后肝癌的发生机制具有重要作用。
本研究选用稳定转染了HBV全基因组，能够持续分泌、表达HBsAg和HBeAg病毒颗粒的HepG2.2.15细胞系作为细胞模型，探索了IFNγ对新型凋亡配体TRAIL与TWEAK的免疫调节作用，为进一步阐明IFNγ对HBV感染肝癌的作用效应奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料重组人sTRAIL、FLAGM2单抗以及重组人sTWEAK蛋白由瑞士洛桑大学Pascal Schneider教授惠赠(sTRAIL 与 FLAGM2单抗共同作用可以构成交联型 TRAIL，从而增强TRAIL的活性[1])。MTT为Sigma公司产品，重组人IFNγ及HBsAg和HBeAg检测试剂盒均购自丽珠集团。流式细胞仪为Becton Dickinson产品。转染HBV全基因组的HepG2.2.15肝癌细胞系，引进后在本室长期培养，以MEM加10%胎牛血清、G418(380mg/L)为培养液，在37℃、5%CO2条件下进行培养。
1.2 IFNγ对病毒抗原的作用取对数生长期细胞的单细胞悬液4.5×105/ml，以每孔100μ1接种到96孔板，培养至对数生长期后，实验组加入浓度为200U/ml的IFNγ，并同时设立不加IFNγ的阴性对照组。分别收获IFNγ作用6，12，24h后的细胞上清液，按照HBsAg及HBeAg ELISA检测试剂盒的步骤检测IFNγ作用不同时段后，HepG2.2.15细胞中HBsAg及HBeAg的分泌状况。每一样品设3个复孔，以450nm波长下，各样品A值的平均值表示HBV病毒颗粒的相对分泌量。
1.3 IFNγ对细胞增殖的影响效应参照1.2方法接种HepG2.2.15细胞至96孔板，培养至对数生长期后，设立TRAIL作用组、TWEAK作用组、TRAIL+IFNγ作用组、TWEAK+IFNγ作用组，并同时设立IFNγ作用对照组和空白对照组。TRAIL与TWEAK的系列作用浓度均为0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml，10ug/ml;IFNγ的作用浓度为200U/ml。各实验孔和对照孔均设3孔重复。MTT(噻唑蓝)以PBS溶解成5mg/ml，过滤除菌，4℃避光短暂保存。细胞培养24h后，每孔加入MTT作用液10μl，继续培养4h。弃上清液，每孔加入二甲亚砜100μl。轻微震荡10min使沉淀溶解后，用酶标仪在波长570nm处测定吸光度A值，以各实验组减去相应对照组的A值代表细胞的存活率。
1.4 IFNγ对TRAIL与TWEAK诱导HepG2.2.15细胞凋亡的调节作用培养HepG2.2.15细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为2×105/孔，按每孔0.5ml的量接种24孔板。37℃、5%CO2条件下培养至细胞达对数生长期，设立TRAIL作用组、TWEAK作用组、TRAIL+IFNγ作用组、TWEAK+IFNγ作用组，并同时设立IFNγ作用对照组和空白对照组。其中sTRAIL和FLAGM2单抗的作用浓度分别为20ng/ml和2μg/ml,TWEAK的作用浓度为20ng/ml,IFNγ的作用浓度为200U/ml。各组分别设3孔重复，继续培养24h后，消化、收集细胞(包括上清中飘浮的细胞)，洗涤、70%乙醇固定过夜，溴化丙啶(PI，Sigma产品)染色，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，结果用ANOVA分析。
2 结果
2.1 IFNγ对HBV病毒分泌表达水平的影响ELISA结果表明，IFNγ作用后HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg检测的A值有明显下降，其中HBeAg表达水平下调幅度更大。这表明，IFNγ对于HBV病毒抗原的分泌表达有抑制作用，相应结果见图1(略)。
2.2 IFNγ对TWEAK与TRAIL诱导的HepG2.2.15细胞生长抑制效应的影响
MTT法检测IFNγ与不同作用浓度的TRAIL与TWEAK对HepG2.2.15细胞的生长抑制效应。结果表明，TRAIL与TWEAK对HepG2.2.15细胞的生长抑制具有剂量依赖性，且IFNγ与TRAIL和TWEAK均有协同效应，能大幅度增强二者抑制细胞生长的作用。IFNγ对TRAIL和TWEAK诱导的生长抑制效应的调节作用分别见图2和图3(略)。
2.3 IFNγ对TRAIL与TWEAK诱导的凋亡的调节作用
流式细胞术检测结果显示，IFNγ作用后，TRAIL诱导的细胞凋亡率由9.12%提高到46.68%(P0.01)，TWEAK诱导的细胞凋亡率由12.11%提高到40.49%(P0.01)。表明IFNγ与凋亡配体在诱导HBV相关性肝癌细胞凋亡方面具有协同效应，流式细胞仪检测的相应结果及分析见图4(略)。
3 讨论
HBV感染后的慢性肝炎、肝硬化和肝癌关系密切，HBV感染机体后引发机体一系列免疫反应，其中凋亡反应便是机体清除病毒感染、变异及转化细胞而维持自身生理状态的主要调节方式之一。TNF家族的多个成员在免疫调节中起关键性作用。FasL是最早克隆、并已进行了大量研究凋亡分子，但随着TRAIL和TWEAK等其它凋亡分子的克隆成功[2~4]，发现原先被认为FasL起主要作用的凋亡反应，其实是由TRAIL和TWEAK单独或者联合作用引起的[5]。TRAIL和TWEAK在机体内广泛分布，持续表达，它们在正常情况下对机体细胞没有损伤，只有在病理状况下激活，发挥诱导凋亡、杀伤肿瘤细胞等病变细胞的效应。因此，TRAIL与TWEAK被认为是机体重要的免疫监视分子，它们通过杀伤突变细胞和病毒感染的细胞，从而在正常机体起到免疫监视作用。
IFNγ被认为是HBV感染机体后诱发的一个非常重要的免疫效应分子。IFNγ主要由T和B淋巴细胞、NK细胞和单核巨噬细胞产生，对调节机体的免疫应答具有重要作用。了解IFNγ是怎样调节HBV感染相关性疾病的免疫反应，是否对机体的凋亡反应进行调节，对阐明HBV相关性肝癌的发病机制具有重要意义。本研究选择了转染HBV全基因组的HepG2.2.15肝癌细胞系，研究IFNγ对HBV相关性肝癌的免疫效应。
本研究结果提示，IFNγ是HBV感染后活化的免疫细胞释放的重要的效应分子，将从多方面对HBV相关性肿瘤的发生进行抑制，将直接抑制HBV病毒的HBsAg和HBeAg的释放，并且协同TRAIL与TWEAK这两个新型的凋亡配体，发挥抑制HBV相关性肝癌细胞的生长和诱导细胞发生凋亡反应的作用，对HBV相关性肝癌的免疫监视效应具有重要的调节作用。
本研究结果对于进一步阐明HBV相关性肝癌的发生机制、逃逸机制以及探索有效的治疗方案具有重要的意义。
参 考 文 献
[1]Pascal Schneider,Nills Holler,JeanLuc Bodmer,et al.Conversion of membranebound fas (CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicit[J].J Exp Med,1998.187:12051213.
[2]Wiley SR,Schooley K,Smolak PJ,et al.Idenification and characterization of new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity,1995,3(6):673682.
[3]Chicheportiche Y,Bourdon PR,Xu H,et al.TWEAK,a new secreted ligand in the tumor necrosis factor family that weakly induces apoptosis[J].J Blio Chem,1997,272:3240132410.
[4]Yagita H,Takeda K,Hayakawa Y,et al.TRAIL and its receptors as targets for cancer therapy[J].Cancer Sci,2004,95(10):777783.
[5]Kaplan MJ,Ray D,Mo RR,et al.TRAIL(Apo2 ligand) and TWEAK (Apo3 ligand) mediate CD4+T cell killing of antigenpressenting macrophages[J].J Immunol,2000,164:28972904.
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(30128023，30371342)，教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(2004.527)，山东省自然科学基金资助项目(2004BS03010)
[作者简介]韩丽辉(1974-)，女，山东济南市人，博士，山东大学医学院免疫学研究所讲师，主要研究方向：分子免疫学。Tel:(0531)88382038 Email:hanlihui@sdu.edu.cn
[通讯作者]孙汶生，Email：wsw@sdu.edu.cn
韩丽辉,等.γ干扰素对HBV相关性肝癌细胞凋亡的免疫调节效应研究
山东大学医学院免疫学研究所(山东济南250012)
