红景天预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响

　　作者：卿德科， 罗 丁， 马根顺 作者单位：(成都军区昆明总医院肝胆外科 成都军区肝胆外科中心， 云南 昆明 650032)

　　【摘要】 目的： 探讨胃饲红景天预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响及其对肝功能的保护作用。方法： 48只健康成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组和红景天预处理组，两组分别予与等量生理盐水、红景天水煎剂(5 g·kg-1·d-1生药材)灌胃5 d，末次灌胃2 h后经第一肝门阻断入肝血流30 min而后松开无创动脉夹，恢复入肝血流，分别于缺血30 min及再灌注后1 h、6 h及24 h各时相点活杀动物取材，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肝组织丙二醛(MDA)，并用TUNEL染色及图像分析法检测肝细胞凋亡率的变化。结果： 与生理盐水对照组比较，红景天预处理组ALT、MDA、肝细胞凋亡率在上述多个时相点显著降低(P<0.05)。结论： 肝脏缺血再灌注前给予红景天水煎剂预处理可以显著降低肝细胞凋亡率，减少MDA含量，并能有效地保护肝脏功能。

　　【关键词】 肝; 再灌注损伤; 缺血预处理; 细胞调亡; 红景天属; 大鼠，SpragueDawley

　　Influence of Salidroside Gastric Feeding Pretreatment on HepatocyteApoptosis Induced by Ischemiareperfusion Injury in Rats

　　QING Deke，LUO Ding, MA Genshun

　　(Department of Hepatobiliary Surgery of Kunming General Hospital of PLA, Hepatobiliary Surgery

　　Centre of Chengdu Command，Kunming 650032, Yunnan, China )

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of salidroside gastric feeding pretreatment on hepatocyte apoptosis induced by ischemiareperfusion injury, and to see if it has any protective effect to liver function. Methods: Fortyeight healthy male adult SD rats were divided randomly into saline control group (group A, n=24), and salidroside pretreatment group (group B, n=24) and pretreated with saline or salidroside (5 g·kg-1·d-1) by gastric feeding respectively for five days. Liver blood flow was obstructed for 30 min by clamping the first porta hepatic in 2 h after the last administration and restored when bulldog clamp was removed. Animals were sacrificed immediately after the ischemia and in 1 h, 6 h, and 24 h after the reperfusion respectively. Their serum alanine aminotransferase (ALT) and liver malonaldehyde (MDA) were determined. Apoptosis in liver was observed with TUNEL (TdTmediated dUTP nick end labeling) stained sections, and analyzed with image analysis technique. Results： ALT serum levels and liver tissue MDA concentrations, and hepatocyte apoptosis index were markedly lower in group B than those in group A (P<0.05) at many time points after liver reperfusion. Conclusion: Pretreatment with salidroside by gastric feeding in rats before ischemiareperfusion could obviously decrease hepatocyte apoptosis, reduce lipid peroxidation, and protect liver function effectively.

　　[Key words] liver; reperfusion injurey; ischemic preconditioning; apoptosis; rhodiola; rats,Spraguedawley

　　临床患者在出血创伤性休克的复苏过程中，或者在行肝脏手术或肝移植术时应用的肝门阻断止血操作过程中，不可避免地会造成肝脏的缺血再灌注损伤，重者可导致肝功能不全乃至死亡的严重后果。因此，如何防治这一损伤一直是肝胆外科临床面临的重大课题。研究发现,肝脏缺血再灌注损伤的过程中,伴随肝脏的缺血缺氧及再灌注，有细胞凋亡的发生并与氧由基的作用密切相关[1]。红景天为景天科红景天属(Rhodiola L.)多年生草本或亚灌木植物,生长在海拔3 500～5 000 m高寒、缺氧、干燥、狂风、强紫外线辐射的恶劣环境中, 千余年来，被我国藏医用于治疗气虚血瘀以及高原环境所引起的各种疾病。新近的研究表明红景天具有抗缺氧、抗氧化、清除自由基、保护细胞膜等药理作用，但未见有红景天在肝脏缺血再灌注损伤方面的研究报道[2]。因此于2008年6月～2009年6月在建立大鼠肝脏原位热缺血再灌注模型的基础上,进行了红景天预处理并检测大鼠肝功能、自由基和肝脏细胞调亡率的变化, 旨在探讨胃饲红景天预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响及其对肝功能的保护作用，为红景天的临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组

　　雄性健康成年SpragueDawley大鼠48只，体重185～215 g，均购自昆明医学院实验动物中心。随机分为生理盐水对照组(A,n=24)和红景天预处理组(B,n=24),分别于缺血30 min及再灌注后1 h、6 h及24 h各时相点活杀动物取材，每时相点观察6只动物。

　　1.2 主要试剂

　　DAB显色试剂盒为美国Roche公司产品，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、MDA检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，细胞凋亡检测试剂盒由福州迈新公司提供。

　　1.3 动物模型的制备及红景天预处理方法

　　动物模型的制备： 术前实验动物禁食12 h，自由进水，3%戊巴比妥钠(3 mg/Kg)腹腔内注射麻醉后取上腹部正中切口，切开腹壁各层，显露第一肝门部，暴露肝十二指肠韧带，按照Pringle法，用精细无损伤血管完全夹闭肝蒂，以此阻断门静脉、肝动脉和胆总管，使肝脏完全缺血，30 min后取下血管夹恢复肝脏血供，然后关腹。

　　红景天水煎剂的制备:红景天250 g，加入蒸馏水，水煎25 min，无菌纱布滤去药渣。水煎第2次15 min，滤去药渣。2次药液混合，蒸馏水调成500 ml 液体(浓度为0.5 g/ml生药材)，放入无菌瓶内，4 ℃保存备用。红景天预处理方法：红景天水煎剂(5 g·kg-1·d-1生药材)连续灌胃5 d，末次灌胃2 h后经第一肝门阻断入肝血流30 min而后松开无创动脉夹，恢复入肝血流，分别于缺血30 min及再灌注后1 h、6 h及24 h各时相点活杀动物取材。生理盐水对照组则取等量生理盐水灌胃，其余后续步骤相同。

　　1.4 TUNEL染色及图像分析、肝功能及肝组织自由基检测

　　用TUNEL法检测凋亡肝细胞,检测程序严格按试剂盒操作说明进行, DAB显色,苏木素轻度复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜下观察并照相。结果判断：细胞核中有棕紫色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，且其形态符合以下4点:单个细胞、周围无炎症反应、胞膜皱缩、胞核致密深染呈棕紫色颗粒或碎片。应用计算机图像处理系统(LEICA计算机图像分析系统)分析切片，每张切片随机取5个视野(×400)，计数出每100个细胞中的阳性细胞数，并以百分数表示作为凋亡指数(AI)，即凋亡细胞指数=阳性细胞数/总细胞数×100% 。血清ALT、肝组织MDA检测按药盒说明书进行。

　　1.5 统计学处理

　　全部数据均以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS11.5统软件进行t检验,分析各组间结果的差异。

　　2 结果

　　2.1 血清ALT活性检测结果

　　缺血30 min，B组与A组比较，差异无统计学意义(P>0.05);再灌注1 h比较，B组较A组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05);再灌注6 h， B组较A组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);再灌注24 h，B组较A组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　2.2 肝组织MDA含量检测结果

　　B组与A组比较，缺血30 min、再灌注1 h、6 h及24 h 4个时相点均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

　　2.3 TUNEL法细胞凋亡的检测结果

　　A组:各时相点均可见散在凋亡细胞并以再灌注后更为明显，再灌注6 h又较再灌注1 h明显增加并达到峰值，但再灌注24 h组较再灌注6 h减少。B组:各时相点均可见散在凋亡细胞，但和A组相比较，凋亡细胞明显减少(见图1、图2)。进一步应用计算机图像处理系统(LEICA计算机图像分析系统)分析切片表明，B组肝组织凋亡指数在缺血30 min、再灌注1 h、6 h及再灌注24 h 4个时相点均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。表1 两组缺血再灌注后不同时相点血清ALT活性的比较表2 两组缺血再灌注后不同时点肝组织MDA活性的比较(μmol/g，n=6，x±s)表3 两组缺血再灌注后不同时点肝组织凋亡指数

　　3 讨论

　　众所周知，肝细胞缺血再灌注损伤时，随着肝细胞的坏死破裂，大量的ALT即被释放到血中因而可被检测，并且已成为临床肝细胞破坏最灵敏的检测指标之一。本实验中，ALT除在缺血30 min这一时相点两组间差异无统计学意义外，其余各时相点均显示红景天预处理组显著低于生理盐水对照组(P<0.05)，提示红景天预处理可能通过某种机制减少了肝细胞的破裂，使得ALT的释放得以减少，这在一定程度上印证了红景天具有拮抗肝脏缺血再灌注损伤并保护肝脏的功能，为其临床应用提供了可期待的前景。

　　本实验的研究还表明，红景天预处理拮抗肝脏缺血再灌注损伤的作用可能与其清除自由基和抗凋亡有关。虽然肝脏缺血再灌注损伤的发病机制目前尚不完全清楚,但研究表明,肝脏缺血再灌注损伤的过程中,有细胞凋亡的发生,与氧自由基的作用密切相关。氧自由基、脂质过氧化在肝脏缺血再灌注损伤的过程中起着重要的作用。在肝脏缺血再灌注过程中,发生超氧化物阴离子自由基反应,可产生大量氧自由基,导致脂质过氧化反应,造成肝细胞肿胀、变性、坏死[3～5]。本实验有关自由基MDA的检测发现，生理盐水对照组在再灌注后，MDA明显升高，随着时间的延长分别在再灌注6 h达到最高点，同时ALT明显升高，提示再灌注后有大量氧自由基的产生并造成肝功能损害。而红景天预处理组各时相点与生理盐水对照组对比，MDA均显著减少 (P<0.05)，反映出红景天不但在缺血期能有效提高细胞耐缺氧能力而降低脂质过氧化，而且在再灌注各时相点也有继续发挥抗脂质过氧化的能力，同时ALT升高幅度也较生理盐水对照组低。MDA与ALT此种平行关系从一个侧面印证了前述自由基在肝脏缺血再灌注损伤的过程中起着重要作用的观点，同时由于MDA在红景天预处理组的相对低含量也从另一个侧面表明了红景天可能通过抑制自由基在肝脏缺血再灌注期的生成和释放而增加了肝脏对缺血再灌注损伤的耐受性。但红景天预处理是否也能通过激活体内抗氧化系统而降低脂质过氧化并减轻肝脏的缺血再灌注损伤尚有待进一步研究。

　　细胞凋亡是不同于细胞坏死的另一种细胞死亡方式，肝脏过度的细胞凋亡同样可导致其功能的衰竭。在肝脏缺血再灌注损伤凋亡研究中，BorghiScoazec G等[6]研究发现，肝细胞凋亡数目和移植后肝存活率显著相关。移植后凋亡细胞数量愈多，肝移植后移植肝的存活率就愈低，原发性无功能的发生率也愈高。Schiosbsger等[7]研究也发现，肝缺血再灌注时细胞凋亡现象是一个不断发生的动态过程，与缺血程度、再灌注时限以及肝组织的血流分布和血中正常营养成分的梯度变化有关，肝细胞凋亡和再灌注损伤造成的生化和病理学参数改变平行。本实验采用先进的凋亡细胞检测技术——TUNEL法,并对凋亡细胞进行原位定性、定量分析，结果发现肝缺血再灌注时细胞凋亡有上述动态的变化，尤其在生理盐水对照组较为显著，再灌注后各时相点凋亡细胞较缺血30 min明显增多，再灌注6 h又较再灌注1 h更多并达到峰值，而再灌注24 h组虽仍可见大量的凋亡细胞，但较6 h减少。这一变化趋势与大鼠血清ALT的变化趋势极为近似，提示细胞凋亡程度与肝脏组织损伤程度可能存在某种平行关系。而应用红景天预处理后，肝组织凋亡指数在缺血30 min、再灌注1 h、6 h及再灌注24 h 4个时相点均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，血清ALT也较生理盐水对照组明显下降，显示了红景天良好的抗凋亡并保护肝功能的效应。

　　总之，肝脏缺血再灌注损伤在导致明显肝脏损伤的同时，伴有脂质过氧化损伤及肝细胞凋亡的增加。肝脏缺血再灌注前给予胃饲红景天水煎剂预处理可以显著减少MDA的含量，减少肝细胞凋亡，从而达到保护肝脏功能的目的。

　　【参考文献】

　　[1]Oshiro T, Shiraishi M, Muto Y. Adenovirus mediated gene transfer of antiapoptotic protein in hepatic ischemiareperfusion injury: the paradoxical effect of Bcl2 expression in the reperfused liver[J].J Surg Res. 2002(1):30-36.

　　[2]赵正维， 王为忠， 陈宏，等.红景天对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床康复，2006(43)：117.

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　　[5]汤劲松，肖兆勇，陈平，等.银杏叶提取物对大鼠、肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及对凋亡的影响[J].实用临床医药杂志，2008(11)：9.

　　[6]BorghiScoazec G, Scoazec JY, Durand F ,et al. Apoptosis after isehemiareperfusion in human liver allografts[J].Liver Transpl Surg, 1997(4):407-415.

　　[7]Schlossberg H，Zhang Y, Dudus L，et al. Expression of cfos and cjun during Hepatocellular remodeling of following ischemia/reperfusion in mouse liver[J].Hepatology，1996(6):1546-1555.