同系与异系移植MMPs、TIMPs表达的比较实验研究

　　作者：甘霖　李生伟　龚建平　彭勇　薛强　殷樱　重庆医科大学第二附属医院肝胆外科(重庆 400010)

　　【摘要】目的：动态观察MMPs、TIMPs在移植动脉中的表达规律，探讨其在移植动脉硬化中的作用。方法：将Wistar大鼠120只、SD大鼠40只随机分为10组，异系(SDWistar)移植组和同系(WistarWistar)移植组各5组，分别于术后3d和1、2、4、8w采取。形态学观察、免疫组织化学SP染色法测定移植段腹主动脉内MMP1、TIMP1，3的表达、Northern杂交定量分析MMP2表达，并加以比较。结果：①术后2~8w异系移植组移植段腹主动脉内膜厚度较同系移植组显著增生(P<005)。②同系移植组MMP1，2和TIMP1较低，峰值均出现于术后2~4w;异系移植组表达显著增加，MMP1，2峰值出现于术后第2w，TIMP1峰值出现于术后第4w。③TIMP3在各组中表达均较低，仅见于细胞外基质中。结论：移植时慢性排斥反应过程中MMPs/TIMPs表达时象及量效的不平衡导致了细胞外基质合成与降解的失衡，是移植物的动脉硬化发生的重要原因。

　　【关键词】移植，同种?动脉?金属蛋白酶组织抑制剂?基质溶解素1

　　Investigation of the expressions of MMPs and TIMPs in rat transplantation arteriosclerosis model of Chronic Rejection

　　GAN Lin,LI Shengwei,GONG Jianping,PENG Yong,XUE Qiang,YIN Ying

　　Department of Hepatobiliary Surgery,The Second Affiliated Hospital,Chongqing University of Medical Science(Chongqing 400010,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To dynamic observe the rule of the expressions of MMPs and TIMPs on the transplanted artery,which is for discussing these functions of transplanted arteriosclerosis.Methods:The expressions of MMPs and TIMPs in the tissues of transplanted abdominal aorta were mensurated by morphology,immunohistochemical SP staining method and the expression of MMP2 was detected by Northern blot quantitative analysis in abdominal aortic orthotopic transplantation model.Results:The thickness of tunica intima of the allografts was much evidently thicker than isografts 2 weeks after transplantation(P<0.05).The expressions of MMPs and TIMPs in the isografts came to the highest on 14th day and then declined.But the expressions of MMPs and TIMPs in the allografts were observably higher tgan the former,and the peak of the expression of TIMP1 was prolonged to 4th week.TIMP3 kept lowly expressed in every groups.Conclusion:The unbalance of expressions of MMPs/TIMPs leading to the turbulence of synthesization and degradation ECM,is an important reason for the process of chronic rejection.

　　【KEY WORDS】Transplantation,homologous?Arteries?Tissue inhibitor of metalloproteinase3?Stromelysin 1

　　慢性排斥反应(chronic rejection,CR )是影响移植物长期存活的最主要障碍，不同移植器官CR的组织学表现不尽相同，但共同的病理特点为移植物的动脉硬化，即移植物血管病变(graft vasculopathy)。来源于小动脉中膜的平滑肌细胞突破内膜基底层向内膜迁移、生长，后期细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度增生而使血管逐渐闭塞、消失。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinass,MMPs)及它的特异性抑制因子金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloporteinass,TIMPs)不仅参与细胞外基质的更新和组织改型，还在血管基底膜的降解、促进中膜平滑肌细胞突破内膜基底层向内膜迁移、浸润的过程中起着相当重要的作用。本研究通过阻断MMPs及TIMPs在同系和异系移植中表达的比较，探讨其在CR中的作用。

　　1材料与方法

　　1.1材料入分组

　　健康雄性Wistar大鼠120只，SD系大鼠40只，年龄4~6个月，体重200~230g 购于重庆市中医药研究所及重庆医科大学动物实验中心。术后随机分成A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10组，每组8只大鼠。其中A、B、C、D、E组为异系(SDWistar)移植组，F、G、H、I、J组为同系(WistarWistar)移植组。所有动物购前均经监测证实健康未带病毒，以按标准喂以混合饲料及清水。10组均分别于术后3d和1、2、4、8w取标本观察。

　　1.2实验仪器及主要试剂

　　采用国产CXSSZZ3型立体手术显微镜及相关显微器械，国产计算机图像分析系统，90无损伤显微外科缝合线，MMP2cDNA探针为本室保存，随机引物法标记试剂盒购于Promega公司，SP免疫组化通用检测试剂盒及MMP1和TIMP1的一抗购于北京中山生物有限公司，TIMP3一抗购于RnD公司。100U/ml肝素乳酸林格液。其它试剂均为国产或进口分析纯。

　　13大鼠大动脉原位移植

　　供鼠以03%的戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔内注射麻醉后，常规消毒、开腹、钝性撕开腹膜后脂肪，显露下腔静脉轮廓，锐性分离动静脉外膜，结扎分支血管。完整切取肾动脉分支到髂血管分岔处一段腹主动脉，长度15~20cm，肝素生理盐水冲冼动脉管腔，放入100U/ml肝素乳酸林格液中，置于4℃冰箱(保存时间均为30min)。受鼠采用乙醚麻醉后同上法游离腹主动脉1.5~2.5采用90无损伤缝合线将供鼠腹主动脉行端端吻合法原位缝合。复流后，检查血管充盈、髂血管博动良好，一层关腹。

　　14 标本采集与检测

　　各组大鼠于相应时点常规麻醉、备皮、开腹、游离移植段腹主动脉 ，用肝素盐水冲净血管腔，切取移植段后①液氮冻存;②10%福尔马林灌注固定标本后分别以苏木素伊红(HE)染色后行形态学观测，上述组织标本均按5μm切片。

　　15 内膜厚度的测定

　　采用计算机图像分析系统，对HE染色切片图像进行灰度换算，自动测量出移植腹主动脉内膜层及中膜层面积，计算出内膜厚度，公式为：内膜层厚度=内膜层面积/(内膜层面积+中膜曾面积)

　　16免疫组化检测

　　标本液氮冻存24h后，冰冻切片，室温晾干。PBS洗2个3min后用3%过氧化氢甲醇液20min，蒸馏水洗，PBS浸泡5min。切片滴加50μl封闭血清，室温放置10min。倾去血清，滴加50μl一抗(MMP1、TIMP1、TIMP3工作浓度均为1∶100)4℃冰箱过夜后用PBS冲洗3个5min。切片上滴加50μl生物素标记二抗(1∶200)37℃温箱孵育30min后PBS 冲洗3个5min。滴加50μl辣根酶标记链霉卵白素(三抗)(1：500)37℃温箱孵育30min后PBS冲洗3个5min。用新鲜配制的AEC液显色5~10min。自来水充分水洗，蒸馏水洗5~10s。苏木素淡染细胞核，自来水洗蓝化。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。为便于定量分析，设不加一抗的作阴性对照组，阴性对照组与阳性染色组取自相邻切片。对免疫组化结果进行定量分析，内膜及中膜各抗体免疫组化相对染色密度指数计算公式为：染色密度指数=单位面积内的阳性染色密度阴性对照染色密度。

　　17 Northern印迹分析

　　采用AGPC一步法分别从各组不同时点的大鼠移植段血管中提取总RNA，取30μg完整无降解的RNA，经1%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上后，与用随机引物法(参照试剂盒说明)标记的MMP2cDNA进行杂交，继而洗膜，放射自显影，用图像分析系统软件对杂交情况进行相对定量分析。

　　18 统计学分析

　　计量数据以x±s表示。应SAS统计软件进行统计处理。两组间差异用t检验。P<005表示差异具统计学意义。

　　2 结果

　　21移植动脉病理变化

　　同系移植组于术后3d动脉层局部见少量炎性细胞浸润，1周左右炎性细胞基本消失，术后2周内膜轻微增生，其后无明显变化。异系移植组于术后3d各层出现较多的炎性细胞浸润，以淋巴细胞和单核巨噬细胞为主，多分布于外膜;1周左右动脉出现内皮剥脱现象，见内膜层增厚，2周炎性细胞浸润程度减轻，细胞外基质成分减少，中层平滑肌细胞通过弹力膜裂隙向内膜迁移出现明显增生细胞层。术后4周内膜层增生达到高峰，出现动脉粥样硬化的典型“半月状”改变，中层有核细胞减少明显，与2周时不同的是细胞外基质成分开始增多。术后8周内膜持续增厚，细胞外基质增生明显，伴内皮修复。

　　22 移植动脉内膜变化及免疫组化染色结果

　　221移植段腹主动脉内膜厚度的动态变化

　　术后同系移植组移植段腹主动脉内膜厚度早期(术后1周内)无明显增生，其后有缓慢的增加趋势，在中、后期(术后2~8周)较同系移植组显著增生(P<005，见表1)，其中2~4周为一个相对增殖高峰期，其后期(术后4~8周)内膜厚度一直持续在较高水平，进入一上增殖平台期。见图1(略)。

　　222　MMP1、TIMP1及TIMP3的动态变化情况

　　术后两组移植段腹主动脉各层均有MMP1和TIMP1的表达。同系移植组MMP1和TIMP1峰值均出现在术后第2~4周，此后逐渐减低(见图2(略))。异系移植组移植段腹主动脉内两者表达较同系移植组显著增加(P<005，见表1)。两组 MMP1和TIMP1的分泌呈典型的单峰曲线。异系移植组MMP1在术后头2周迅速合成、分泌，在第14天左右其相对染色密度指数达峰值为189±37，其后呈阶梯状下降;TIMP1在术后前4周大量产生，在第28天左右其相对染色密度指数达峰值为223±37，其后呈缓慢下降趋势(见图3(略))。MMP1和TIMP1的表达在炎性细胞周围及新生内膜“增生前沿”附近分布较多、且较集中。而TIMP3在术后两组移植段腹主动脉内仅在ECM中有少量的表达，同/异系移植组比较，除第1周时，差异均无统计学意义(P>005，见表1(略))。表1术后各时点两组移植段腹主动脉内膜厚度及MMP1、TIMP1、TIMP3相对染色密度指数变化

　　23 移植术后MMP2基因水平的变化

　　从同/异系移植组不同时间的移植段腹主动脉提取的RNA与MMP2cDNA探针杂交后，可见在约31kb的位置附近出现一条杂交区带，对比各组结果杂交信号的强弱可见，同系移植组移植段腹主动脉MMP2基因表达水平相对较低，第2周时开始增加，为该组第3d强度的41倍，到第4周时其表达活性达到峰值，是该组第3d强度的57倍，随后其表达活性逐渐降低，在第8w时恢复为第3d 的水平;而异系移植组移植段腹主动脉，该基因的表达被显著诱导：在第1w时，是该组第3d强度的72倍，第2w时，其表达活性达到高峰，是该组第3d强度的95倍;其后，随着术后时间的增加，MMP2基因的表达呈现下降的趋势，在第8w时MMP2基因的表达与第3d基本相同(见图4(略))。

　　3 讨论

　　慢性排斥反应(CR)是移植物远期丢失的主要原因，CR最基本的病理特点为移植物的小动脉的硬化，小动脉中膜的平滑肌细胞(SMC)突破内膜基底层向内膜迁徙、过度生长、坏死、纤维化而使血管逐渐闭塞、消失，最终使移植物丢失。

　　MMPs及其特异性内源抑制因子TIMPs参与细胞外基质(ECM)的更新和组织改型[1]，据Hayry等研究[2]平滑肌细胞向内膜浸润时发现，MMPs对血管ECM的降解起着相当重要的作用，与此同时TIMPs又能特异的以1∶1非共价的形式与之结合，使MMPs失活。所以MMPs/TIMPs之间的平衡对ECM各种成分的合成与降解起着重要的调节作用。我们的实验表明MMP1、MMP2及TIMP1、TIMP3不仅存在于同系移植组移植供体中，更存在于异系移植组标本中。通过免疫组化染色及Northern印迹分析可知，在同系移植组中MMP1、MMP2和TIMP1的表达量较异系移植组低，峰值均出现在术后第2~4w左右;而异系移植组中三者均显著增高，MMP1、MMP2的表达峰值出现在第2w，TIMP1的表达峰峰出现在第4w。由此推测，由于MMPs/TIMPs表达时象及量效的不平衡导致了ECM合成与降解的失衡，最终使移植物的动脉硬化发生。其具体机制可能是：一些生长因子或细胞因子，如bFGF、PDGF等能显著刺激MMP2表达[3]。术后早期血管内皮细胞对缺血、缺氧最敏感，受损的内皮细胞合成与分泌这些因子增加，它们作为MMP2基因表达的诱导因子，促进MMP2基因表达，分解ECM，进而引发SMC向内膜层迁移与增殖;术后中、后期由于CD4+/CD8+比例大大增加[4]，及大量炎性细胞的刺激产生TPA、IL1、IL10、ILβ、ΝΟ、RΑ等均可诱导TIMP1的转录[5]，活化的多个信号传导途径又参与了TIMP1的表达上调，如蛋白激酶A和C依赖的信息传导通路。后期TIMP1抑制了MMPs的活性，使胶原在细胞外堆积，可能是移植后期移植动脉硬化的主要原因。我们研究还发现，TIMP3在同/异系移植组中均表达较低，但我们在体外的研究实验表明(另文发表)，TIMP3除了特异性抑制MMPs的活性外，还具有抑制血管内膜细胞增殖、迁移、促进细胞凋亡的作用。如在CR发生的早期阶段即诱导TIMP3的表达，干预MMPs/TIMPs间的平衡，抑制MMPs对基质的降解，阻碍SMC的迁徙，可能是减缓CR发生的有效途径。

　　参 考 文 献

　　[1]Brew K,Dinakarpandian D,and Nagase H.Tissue inhibitors of metalloproteinases:evolution,structure and function[J].Biochim Biophys Acta,2000,1477:267283.

　　[2]Hayry P.Chronic rejection:risk factors,regulation,and possible sites of therapeutic intervention[J].Transplant Proc,1980,30:24072410.

　　[3]Solomon A,Li DQ ,Lee SB,et al.Regulation of collagenase,stromelysin,and urokinasetype plasminogen activator in primary pterygium body fibroblasts by inflammatory cytokines[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:21542163.

　　[4]Legare JF,Issekutz T,Lee TDG,et al.CD8+T Lymphocytes Mediate Destruction of the Vascular Media in a Model of Chronic Rejection[J].Am J Pathol,2000,157:859865.

　　[5]Farina AR,Coppa A,Tiberio A,et al.Transforming growth factorbetal enhances the invasiveness of human MDAMB231 breast cancer cells by upregulation urokinase activity [J].Int J Cancer,1998,75:721730.

　　甘霖,等.同系与异系移植MMPs、TIMPs表达的比较实验研究

　　[基金项目]重庆市卫生局科研基金资助项目(渝卫科教[2001]012072)

　　[作者简介]甘霖(19791-)，男，重庆市人，硕士，重庆医科大学附属第二医院肝胆外科，研究方向：肝移植。Tel：13594684834

　　[通讯作者]李生伟，Tel：(023)63848842