环孢霉素A预处理对大鼠移植肝脏影响的实验研究

　　作者：苏永红　徐克森　陈雨信　李海林

　　【摘要】目的：研究环孢霉素A(CsA)预处理保存大鼠肝脏对原位移植后的植肝功能影响。方法：将大鼠随机分为A组(对照组，HTK液保存组)和B组(实验组，HTK液+CsA保存组)，两组均保存12h后行原位肝移植，分别于供肝保存0h、12h及植术后7d检测各组血清谷丙转氨酶(AST)，谷草转氨酶(AST)，乳酸脱氢酶(LDH)浓度及各时间段线粒体呼吸功能RCR及P/O值。通过HE染色及原位凋亡染色观察各组肝脏组织细胞形态学改变及凋亡情况。结果：B组血清ALT、AST、LDH活性于保存12h显著低于A组，B组各时间段RCR及P/O值于保存12h，移植术后0.5h及术后7d均高于A组。细胞形态学检查B组移植肝组织细胞结构改变轻微，凋亡指数于保存12h，术后0.5h均低于A组。结论：CsA预处理供肝主要通过保护线粒体功能减轻冷保存期和再灌注对大鼠供肝的损伤及抑制肝细胞的凋亡，使大鼠原位肝移植后存活率升高。

　　【关键词】肝移植?环孢菌素?线粒体?细胞凋亡?大鼠

　　Cyclosporine A preconditioning on liver preservation and transplantation in rat

　　SU Yonghong,XU Kesen,CHEN Yuxin ,LI Hailin

　　Department of General Surgery of Qilu Hospital,Institnte of Hepatobiliary and Vascular Surgery,Shandong University

　　【ABSTRACT】Objective:To study the effect of Cyclosporine A preconditioning on liver preservation and transplantation in rat.Methods:Rats were divided randomly into control group (group A,HTK solution preservation) and CsA precondioning group (groupB,HTK solution preservation+1μM CsA).The livers of two groups were had been all preservated for 12 hours before operation of orthotopic liver transplantation.The content of serum AST,ALT,LDH were all assayed during preservation in 0h,12h and 7d post liver transplantation,as well as determination of mitochondrial respiration function parameters (RCR and P/O).The change of cell morphology and apoptosis were also observed by TUNEL stain,and miclroscopes in two groups.Results:The content of serum ALT,AST and LDH in group B were less than in group A after presenvation for 12 hours.RCR and P/O parameters of mitochondrial respiration in group B on preservation for 12h.and for 30 min after operation were more than in group A.Cell morphology and apoptosis changed slingtly compared with group B.Conclusion:CsA preconditioning can relieve injury of donated liver during cold preseration and reperfusion.It protects mitochondrial fuction of liver cells and inlibits cell apoptosisa.

　　【KEY WORDS】Liver transplantation?Cyclosporine?Mitochondrial?Apoptosis?Rats

　　供肝质量是保证肝移植术后功能正常发挥的有效保障，无论哪种保存液都不可能逆转冷缺血本身及移植后再灌注对供肝损伤作用，因此探讨减少供肝损伤的有效措施是保证肝移植成功的重要因素。研究证实，环孢霉素A(CsA)有特异性抑制线粒体可渗透转移小孔(PTP)作用，通过保护线粒体功能来保护组织细胞。最近报道其在离体肝脏低温保存再热灌注模型中对肝脏有保护作用，但应用在大鼠原位肝移植模型中少见。本研究通过CsA预处理低温灌注保存供肝12h行原位肝移植，探讨CsA预处理对移植肝脏的保护作用，为临床应用提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　CsA(瑞士Sandoz公司)、HTK液(北京西赛尔医疗设备经销有限公司经销)、凋亡试剂(Sigma公司)、ADP(Sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 实验动物与分组

　　雄性成年SD大鼠(第三军医大学大坪医院动物所，清洁级)50只，体重(220±20)g。A组：对照组(HTK液冷灌注保存)15只，其中10只作为供肝行原位肝移植，5只保存期取标本。B组：实验组(HTK冷灌注保存+1μMCsA)，15只，分配同A组。20只随机分为两组作为受体。

　　1.3　方法

　　原位肝移植模型的建立，采用改良Kamada法[1]。动物术前12h禁食不禁饮，乙醚吸入麻醉后横切口入腹，阴茎背静脉推入肝素液2ml(含肝素100U)。游离腹主动脉主干向上达肝动脉分支处以上，向下达左右髂血管汇合处，小血管钳夹闭左右髂血管汇合处，在其上 0.5处以20G套管针穿刺腹主动脉，以40ml 4℃HTK液(对照组)或等体积4℃dHTK液+1μMCsA(实验组)按150ml/h速度注入，静脉微量输液泵维持，同时于肝动脉分支以上处夹闭腹主动脉观察肝脏颜色变化，待供体肝变为土黄色游离供肝，放入盛有50ml 4℃HTK液或等体积处理的保存液的玻璃培养皿中4℃冰箱保存。供肝修整后分别套入门静脉及肝下下腔静脉袖套，保存12h后，行原位肝脏移植。术后灯照保暖，自由进水，移植后7d处死动物取标本。

　　1.4 指标检测

　　1.4.1 ALT、AST及LDH含量检测

　　分别于供肝保存0h、12h、移植术后7d，取各组灌注保存液或血液2ml在TECHNICONRA1000全身动化分析仪上检测。

　　1.4.2 RCR和P/O测定

　　按Catherine[2]法，取肝组织各时间段(0h、12h,复流后0.5h,术后7d)线粒体，在生物氧活性监测仪上，加入含0.22M蔗糖反应介质，待曲线稳定后，依次加入100μl线粒体后加入0.2M琥珀酸钠40μl，ADP 8μl，检测呼吸功能比值(RCR)及磷氧化(P/O)值。

　　1.4.3 细胞形态学观察

　　(1)光镜：取各时间段肝组织，按常规方法制片，HE染色，光镜下观察;(2)原位凋亡细胞检测：用TUNEL法行肝组织切片，取肝组织10%中性甲醛固定24h，常规石蜡包埋并切片，二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水，预处理后，加入TDT酶及底物，DAB显色，细胞核棕黄色着色的为凋亡细胞。每个标本的切片随机选取10个400倍视野，计数调亡细胞，以千分数表示凋亡指数(AI)。

　　1.4.4 大鼠存活率

　　比较两组移植后7d大鼠存活率。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS 10.0统计软件分析，计量资料以x±s表示，两组间均数比较用OneWay ANOVA检验。

　　2 结果

　　2.1 两组血清ALT、AST、LDH含量见表1。表1 两组各时间段血清ATL、AST、LDH含量(略)

　　2.2两组各时间段呼吸功能RCR及P/O比较见表2。表2 两组各时间段呼吸功能RCR及P/O比较表2可见两组RCR和P/O均复流后0.5h均明显低于保存前。

　　2.3 光镜检查

　　B组肝细胞肝小叶、静脉、汇管区结构于保存12h时尚清晰，复流后1/2h后汇管区有轻度炎细胞浸润，7d后炎症明显减轻。A组变化较B组重，复流后半小时可见点状坏死区。见图1(略)。

　　2.4　凋亡指数、见表3。表3 两组各时间段肝组织凋亡指数(略)

　　2.5 存活率

　　肝移植存活率对照组为5/10，实验组为7/10。

　　3　讨论

　　低温灌注保存肝脏是目前肝脏移植试验研究及临床研究最常用方法，冷保存损伤是引起肝移植原位肝功能障碍的主要原因之一[3]，主要表现在以下几个方面：①细胞水肿;②组织细胞结构的改变;③氧自由基的产生④钙离子的超载;⑤ATP的降解;⑥酸碱平衡的紊乱等。其中线粒体结构功能的损伤是影响细胞功能的主要因素。崔泳[4]等在冷保存鼠肝脏肝细胞线粒体分离的研究中发现;4℃下生理盐水保存1h的肝脏线粒体可见肿胀，但大部分结构基本完整，轮廓和内膜嵴尚清楚，保存2h内膜嵴不清晰，有空泡形成，3h线粒体结构开始不完整，内膜嵴消失，4h见线粒体结构基本消失。

　　减少低温保存期的损伤尤其是线粒体的损伤是保证移植术后移植肝功能正常的有效手段。CsA为免疫抑制剂，但近年来研究证实[5]，CsA具有特异性抑制线粒体可通透性转化小孔(PTP)开放的作用。Boya[6]等发现PTP是线粒体内外信息交流关键部位，其开关状态与其功能有密切关系。在应激条件下如缺血冷保存等情况下CsA可抑制PTP开放，防止线粒体内活性介质进入胞质引起细胞损伤。

　　本研究发现，CsA处理后肝脏保存12h时肝功能3种酶的浓度均低于对照组，说明肝脏细胞损伤减轻。RCR及P/O值是线粒体功能灵敏指标，是细胞活性功能的指标之一。本实验结果显示，B组在保存12h及复流后0.5hRCR/及P/O值均高于A组，两组RCR及P/O值复流后0.5h下降明显，但B组变化轻，说明CsA对线粒体具有保护作用，并在再灌注时减轻损伤，可促进肝功能恢复。实验通过凋亡指数显示,在保存12h及再灌注后B组调亡较A组轻，显示CsA在一定程度上有减轻凋亡的作用[7~9]。可能的机制为，低温保存及再灌注时由于细胞损伤引起PTP开放被CsA抑制，减轻了线粒体内的凋亡介质如细胞色素C、Caspase9、Caspase3等释放引起级联调亡反应，一定程度上抑制了凋亡的发生。目前已知，线粒体内与调亡有关的活性介质主要有细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)及Smac/DIABLO蛋白等，这些因子会受到位于线粒体膜的Bcl2家族蛋白的调节。

　　研究结果发现，CsA只能从某种程度上可减轻供肝冷保存损伤及再灌注损伤，提高原位移植后大鼠的7d存活率，但机制尚等进一步研究。

　　参　考　文　献

　　[1]Kamada N,Calne R Y.Orthotopic liver transplantation in the rat.Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage[J]Transplantation,1979,28:47503.

　　[2]Catherine Plin,Pierre S Haddad,JeanPaul Tillement,et al.Protection by cyclosporin A of mitochondrial and cellular functions during a cold preservationwarm reperfusion of rat liver[J].Eur Pharmacol,2004,495:111118.

　　[3]Marti Ramon,Murio Enric,Varela Encarna,et al.Xanthine oxidoreductase and preservation injury in human liver transplantation[J].Transplantation,2004,77:12391245.

　　[4]崔泳.冷保存鼠肝脏肝细胞线粒体的分离[J].中国医科大学学报，2000，29(4)：312.

　　[5]Feldmann G,Haouzi D,Moreau A.D et al.Opening of the mitochondrial permeabitity transition pore causes matrix expansion and outer membrane rupture in Fasmediated hepatic apoptosis in mice[J].Hepatology 2000,31:674683.

　　[6]Boya P,Roques B,Kroemer G,et al.Viral and bacterial proteins regulatingapoptosisatthemitochondriallevel[J].BMBOJ,2001,20(16):4325.

　　[7]Soriano Maria Eugenia Nicolosi Luca Bernardi Paolo.Desensitization of the permeability transition pore by cyclosporin a prevents activation of the mitochondrial apoptotic pathway and liver damage by tumor necrosis factoralpha[J].Biol Chem,2004,279:3680336808.

　　[8]Kim JaeSung，Qian Ting，Lemasters John J.Mitochondrial permeability transition in the switch from necrotic to apoptotic cell death in ischemic rat hepatocytes[J].Gastroenterology,2003,124:494503.

　　[9]La Piana Gianluigi,Marzulli Domenico,Consalvo Maria Irno,et al.Cytochrome cinduced cytosolic nicotinamide adenine dinucleotide oxidation,mitochondrial permeability transition,and apoptosis[J].Arch Biochem Biophys,2003,410:201211.

　　[基金项目]山东省自然科学基金资助项目(Y2003C15)

　　苏永红，等.环孢霉素A预处理对大鼠移植肝脏影响的实验研究

　　山东大学齐鲁医院普外科肝胆血管外科研究所(山东济南 250012)