增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo治疗胰腺癌的体外实验研究

　　作者：方益锋，张启瑜，吕和平，单云峰，周蒙滔    作者单位：温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000 　　【摘要】  目的 研究携带人内皮抑素基因的新型双重调控增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo对胰腺癌细胞的体外治疗作用。方法 采用四氮唑盐比色法(MTT)测定不同滴度的病毒AdTPHre-hEndo、Ad-hEndo、ONYX-015、Wad5对胰腺癌细胞和正常细胞的杀伤效应，通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力，利用Western blotting和ELISA检测人内皮抑素治疗基因的表达。结果 AdTPHre-hEndo、Ad-hEndo、ONYX-015、Wad5感染胰腺癌细胞杀伤的半数有效量(ED50)分别是MOI=0.624、MOI>100、MOI=0.781和MOI=0.284;感染正常细胞时Wad5的ED50为MOI=0.976，余三种病毒均为MOI>100。增殖实验结果证实AdTPHre-hEndo可以选择性地在胰腺癌细胞中增殖。随着AdTPHre-hEndo感染时间的延长，肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加，第7天达(310.25±1.41)ng/mL，明显高于感染正常细胞时的表达量(95.24±2.26)ng/mL(P<0.01)。结论 AdTPHre-hEndo介导的治疗基因表达量在胰腺癌细胞中可得到放大，在胰腺癌细胞中具有特异性增殖及杀伤能力。

　　【关键词】  腺病毒;内皮抑素;胰腺肿瘤;增殖;基因表达调控，病毒

　　An study for the effect of newly constructed replication-selective adenovirus AdTPHre-hEndo on pancreatic cancer in vitro FANG Yifeng， ZHANG Qiyu， LV Heping， et al. Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000Abstract Objective To investigate the effect of a newly replicating adenovirus vector AdTPHre-hEndo carrying anti-tumor endostatin gene on pancreatic cancer cells. Methods The cytotoxicity of AdTPHre-hEndo on SW1990 and CCC-HPE-2 cells was assessed with a colorimetric assay method and was then compared with that of Ad-hEndo， ONYX-015 and Wad5 on the same cells. The transgene expression of endostatin was detected with Western blotting assay and was also quantitatively analyzed with ELISA assay. Results The cytotoxicity ED50 (50% median effective dose) of AdTPHre-hEndo to normal cell lines CCC-HPE-2 was 160 fold of that to SW1990 cell lines. The tumor-selective cytotoxicity of AdTPHre-hEndo in pancreatic cancer cells was observed. Compared with Wad5， the cytotoxicity of AdTPHre-hEndo was both attenuated in pancreatic cancer cells and normal cells. The cytotoxicity of AdTPHre-hEndo was superior to that of ONYX-015. Proliferative test revealed that AdTPHre-hEndo could proliferate selectively in tumors. Furthermore， in comparison with normal cells， the transgene expression of endostatin mediated with AdTPHre-hEndo was significantly higher (P<0.01). Conclusion AdTPHre-hEndo is capable of replicating and lysing pancreatic cancer cells selectively. Amplified expression of the therapeutic gene Endostatin mediated by AdTPHre-hEndo in pancreatic cancer cells versus Ad-hEndo was observed in vitro.

　　Key words adenovirus; endostatin; pancreatic neoplasms; replication; gene expression regulation， viral

　　临床研究表明，传统肿瘤的基因治疗方案是安全的，但其治疗效果却非常差，其主要原因是传统的基因治疗载体系统存在着体内转染率低、抗癌基因表达量低及不能特异靶向肿瘤细胞等缺点，从而不能将抗癌基因转染到大量的肿瘤细胞中并使之高效表达。寻找一个高效、靶向的基因导入系统，是肿瘤基因治疗急需解决的一个关键问题。基于此，我们考虑利用基因工程的方法对腺病毒进行有效的结构改造，使改造后的腺病毒能在肿瘤细胞中特异性增殖，并携带某种肿瘤治疗基因，这样病毒感染肿瘤细胞后即可在细胞内增殖裂解并高表达治疗基因。为此本实验构建了受端粒酶逆转录酶启动子控制腺病毒E1A基因表达、低氧反应元件启动子控制E1B基因表达并携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒载体AdTPHre-hEndo，并对其进行胰腺癌的体外研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要载体、材料和细胞培养 pBHGE3载体购于加拿大Microbix Biosystems公司;质粒pTP、pAd-HRE购于美国Promega公司，BglII、XbaI、KpnI、SwaI、NotI核酸内切酶购自美国NEB公司。ONYX-015、Wad5 (野生型5型腺病毒)购于生物基因公司。293细胞(腺病毒E1区转化的人胚胎肾细胞株)、胰腺癌细胞株SW1990、AsPC-1及正常的人胚胎胰腺组织来源细胞CCC-HPE-2购自上海中科院细胞生化所。各细胞株培养液、培养血清及抗生素参照供应商推荐，在37 ℃、5%CO2条件下培养，0.25%胰酶消化细胞、传代。

　　1.2 双重调控增殖型腺病毒质粒pTPHre-hE的构建及病毒的包装 将质粒pTP经NotI和SwaⅠ酶切，获得320 bp的hTERT启动子、10.3 kb的线性化载体片段，设计合成Linker头并磷酸化(5′-GCGGCCACACTAGTGAGATCTAGTCGACGCGGCCGCG-ATTT-3′)，与10.3kb线性化载体片段连接，引入多克隆位点，构建成pTP1。将pTP1用NotI和SwaI酶切，获得的10.4 kb线性化载体与hTERT启动子连接，将hTERT启动子插入到E1a上游，构建成pTP2;质粒pAd-HRE用XbaI和KpnI酶切后获得的900 bp左右的片段与pTP2用XbaI和KpnI酶切后获得的线性化载体连接，HRE便成功插入含有完整E1b基因的载体中，构建成载体pTP-HRE。采用正常肝组织，提取总RNA，RT-PCR扩增人内皮抑素基因。人内皮抑素基因上游引物P1：5′-GCCACAGCCACCGCGACTTCC-3′;下游引物P2：5′-AATGCATAGCACGATGTAGGC-3′。将扩增的片段克隆至pBluescriptⅡ质粒载体，测序证实序列正确后将内皮抑素基因克隆至pAd-HRE 的EcoRI 和XbaI位点， 构建成表达载体pAd-hE。BglⅡ酶切pAd-hE，将含CMV启动子、hEcDNA、PolyA 加尾信号的1 217 bp片段克隆至pT-PHRE的BglⅡ位点，构建成携带内皮抑素基因的双重调控增殖型腺病毒质粒pTPHre-hEndo。将质粒pTPHre-hEndo与腺病毒右臂包装质粒pBHGE3共转染293细胞，在细胞内重组、扩增增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo，收获的病毒液经氯化铯纯化后测定滴度，冻存于-80℃待用。

　　1.3 病毒增殖实验 分别用AdTPHre-hEndo、ONYX-015和Ad-hEndo病毒以MOI=5感染在6孔板中单层培养的胰腺癌细胞株SW1990和AsPC-1及正常的胰腺细胞株CCC-HPE-2，2 h后吸去病毒液，换用5%血清培养液，放置CO2孵箱中培养。收集感染48 h细胞冻融液及上清。-80℃反复冻融3次， TCID50法检测病毒滴度，以0 h病毒滴度为参照，其他不同时间点的病毒滴度与之相比算出病毒增殖倍数。

　　1.4 细胞杀伤实验 将处于对数生长期的胰腺癌细胞株SW1990和正常细胞株CCC-HPE-2以0.1 mL/孔(约1×104个)接种至96孔细胞培养板，CO2孵箱24 h后，分别以MOI=0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100的梯度滴度的AdTPHre-hEndo、Ad-hEndo、ONYX-015和Wad5病毒液感染，2 h后换2%血清培养液，置于37℃ 5% CO2孵箱培养7 d后每孔加入5 mg/mL的MTT工作液10 ?滋L(终浓度0.5 mg/mL)，置于CO2孵箱4 h后，加入三联液(10%十二烷基硫酸钠+5%异丁醇+0.012 mol/L盐酸)100 ?滋L/孔，12 h后在570 nm及630 nm双波长下用酶标仪测定每孔的吸光度(OD)，以空白对照孔为零。计算各组的OD值均数及标准差，并用以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=(OD实验组-OD空白对照组)/(OD阴性对照组-OD空白对照组)×100%。分别检测AdTPHre-hEndo对胰腺癌细胞和正常细胞的杀伤作用，并与Ad-hEndo、ONYX-015和Wad5相比较。

　　1.5 酶联免疫吸附法(ELISA)检测人内皮抑素的表达 将胰腺癌细胞SW1990和正常细胞CCC-HPE-2以5×105个/孔铺24孔板，24 h后换无血清培养液，以MOI=1用AdTPHre-hEndo感染各细胞株，感染2 h后换2%胎牛血清培养液，收集病毒感染后第1、3、5、7天后的细胞培养上清液。人内皮抑素ELISA试剂盒购于R&D Systems公司，操作详见产品说明书。

　　1.6 Western blotting测定AdTPHre-hEndo在人内皮抑素蛋白的表达 将对数生长期的胰腺癌细胞SW1990、AsPC-1和正常细胞CCC-HPE-2以1×105个/孔铺24孔板，24 h后换无血清培养液，以MOI=1分别用AdTPHre-hEndo和Ad-hEndo取病毒感染48 h镜下观察细胞形态发生明显改变时收集细胞培养上清液，紫外分光光度计对总蛋白进行定量。兔抗人内皮抑素抗体及HRP标记的羊抗兔二抗均购自R&D Systems公司。

　　1.7 统计学方法 实验数据均以均数±标准差表示，采用Student t检验判断两个样本均数之间有无差别，病毒杀伤实验的结果采用ANOVA可重复测量的双因素分析。

　　2 结果

　　2.1 携带人内皮抑素基因的病毒质粒鉴定 PCR扩增pAd-hE中的hEndo基因，得到648 bp片段，经测序完全正确。进一步插入腺病毒载体，得到质粒pTPHre-hEndo。pTPHre-hEndo经BglⅡ酶切得到 1 217 bp(含CMV启动子、hEcDNA、PolyA加尾信号)和10.1 kb两片段，证明病毒质粒载体正确(见图1)。

　　2.2 选择增殖型腺病毒TPHre-hEndo的重组获得 将质粒pTPHre-hEndo与腺病毒右臂包装质粒pBHGE3共转染293细胞，在细胞内重组腺病毒，提取重组腺病毒DNA，PCR鉴定正确，命名为AdTPHre-hEnd。经过扩增纯化，滴度为3.25×1010。

　　2.3 病毒增殖实验 以0 h的病毒滴度为基准，计算出感染48 h后病毒增殖倍数，AdTPHre-hEndo在SW1990和AsPC-1中的增殖倍数分别是(2140±183) 和(2876±112)，分别是正常CCC-HPE-2细胞增殖倍数的1132倍和1522倍;ONYX-015在SW1990和AsPC-1的增殖倍数分别是(973±130)和(1055±72)，AdTPHre-hEndo在两种胰腺癌细胞株中的增殖倍数明显高于ONYX-015(P<0.01);而Ad-hEndo在3种细胞株中均无明显的增殖。

　　2.4 MTT实验检测病毒的杀伤力 不同滴度的病毒对胰腺癌细胞及正常细胞的杀伤实验结果如图2所示，并由MTT比色测定法通过计算得出半数有效量(ED50)值。Wad5对SW1990细胞和CCC-HPE-2细胞杀伤的ED50分别是MOI=0.284和MOI=0.945;AdTPHre-hEndo对SW1990细胞和CCC-HPE-2细胞杀伤的ED50分别是MOI=0.624和MOI>100，AdTPHre-hEndo对正常细胞的杀伤ED50是对胰腺癌细胞ED50的160倍以上(P<0.01);ONYX-015对SW1990细胞和CCC-HPE-2细胞的ED50分别是MOI=0.781和MOI>100，对正常细胞的杀伤ED50是对胰腺癌细胞ED50的110倍以上(P<0.01);Ad-hEndo对二株细胞的ED50都为MOI>100，对正常细胞的杀伤ED50和对胰腺癌细胞ED50无明显改变。与Wad5相比，AdTPHre-hEndo和ONYX-015对胰腺癌细胞和正常细胞的杀伤力均减弱;AdTPHre-hEndo对胰腺癌细胞的杀伤强于ONYX-015;AdTPHre-hEndo对正常细胞杀伤近似于Ad-hEndo，但明显弱于Wad5，而对胰腺癌细胞的杀伤明显强于Ad-hEndo。

　　2.5 ELISA检测治疗基因的表达 结果显示，在AdTPHre-hEndo感染SW1990细胞的7 d内，随时间延长细胞培养上清液中内皮抑素蛋白浓度不断增高，在感染后的第7天，表达量达到(310.25±1.41)ng/mL，明显高于感染正常CCC-HPE-2细胞7 d时细胞培养上清中的浓度(95.24±2.26)ng/mL(P<0.01)。

　　2.6 Western bloting检测治疗基因的表达 Western blotting分析结果显示，AdTPHre-hEndo和Ad-hEndo在两种胰腺癌细胞中均有治疗基因蛋白表达，但AdTPHre-hEndo表达条带比Ad-hEndo浓厚，与293细胞阳性对照浓度相似;AdTPHre-hEndo在正常细胞CCC-HPE-2中表达条带与携带同一治疗基因的非增殖病毒Ad-hEndo的表达相似(见图3)。

　　3 讨论

　　肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成[1]，因此抗肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗主要策略之一。在众多的血管抑制剂当中，内皮抑素(endostatin)最受关注，它具有高效、无免疫原性的特点，并且克服了肿瘤治疗中最棘手的耐药性和组织毒性问题[2]。内皮抑素具有明确的剂量依赖性作用[3]，因而一个高效、安全的基因导入载体系统，即在尽可能不杀伤正常细胞的前提下将治疗基因特异性地传输到肿瘤细胞中并获得高效的表达，对内皮抑素充分发挥其抗肿瘤治疗有着重要意义。

　　利用肿瘤细胞存在某些基因表达上的差异，构建出在肿瘤细胞内特异性增殖及复制的肿瘤特异性增殖病毒，在肿瘤的基因治疗中越来越受到关注，其显著的特点就是能够特异性地在肿瘤细胞中增殖并杀灭肿瘤细胞。美国ONYX制药公司研究的E1B 55 kD缺失的腺病毒ONYX-015就是利用肿瘤细胞中p53 基因突变而正常细胞中p53正常的差异使病毒在肿瘤细胞中特异性增殖。与传统化疗联用，ONYX-015 的有效率在50%以上，但它在体内半衰期短，需要反复注射，必须与不良反应较大的放化疗联合应用才能有效地杀伤肿瘤[4-6]。因此，我们设想应用上述病毒携带某种对肿瘤治疗有明确疗效的抗癌基因，利用这类病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞内不增殖的特点来为肿瘤治疗提供新的策略。

　　肿瘤的无限增殖能力主要靠端粒酶的激活维持端粒的长度而达到。利用端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)来调控病毒复制增殖所必需的基因，理论上可使病毒选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中增殖。在肿瘤细胞的恶性增殖过程中，不断增多的肿瘤细胞导致细胞耗氧量剧增，容易造成肿瘤内低氧微环境。低氧进而可诱导缺氧诱导因子-1(HIF-1)的形成，它与一系列低氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件(HRE)结合，从而启动靶基因的转录表达[7]。鉴于肿瘤生长的无限增殖能力和肿瘤组织内的低氧内环境，我们构建了以hTERT调控E1A、HRE调控E1B并携带hEndo治疗基因的肿瘤特异性增殖型病毒AdTPHre-hEndo，以期达到对治疗基因的高表达及在不降低对肿瘤细胞特异性杀伤作用的同时减弱病毒毒性的目的，并以Ad-hEndo、ONYX-015和Wad5为对照，通过体外细胞试验对AdTPHre-hEndo进行评估。初步的实验结果表明该病毒同样具有类似于ONYX-015的特点，可选择性在胰腺癌细胞中增殖。我们通过MTT比色测定法计算出ED50值从量化角度评价AdTPHre-hEndo选择杀伤能力，与Wad5相比，AdTPHre-hEndo和ONYX-015对胰腺癌细胞和正常细胞的杀伤力均减弱，这说明外源基因的导入或对病毒基因进行改造影响了病毒对正常细胞的杀伤能力，而且AdTPHre-hEndo对胰腺癌细胞的特异性杀伤力，相对于ONYX-015明显提高，同时增殖型腺病毒的杀伤力亦明显强于携带hEndo治疗基因的非增殖型腺病毒Ad-hEndo。增殖及杀伤实验结果表明增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo具有在胰腺癌细胞中特异性增殖并直接裂解胰腺癌细胞的能力，并优于ONYX-015。另一个重要的意义是人内皮抑素基因可以随着病毒的大量复制在肿瘤组织内得到特异性放大，对细胞培养上清液中内皮抑素的Western blotting检测及ELISA定量分析证实了此推断。

　　增殖型腺病毒介导的基因治疗具有肿瘤病毒治疗和基因治疗的双重优势[8]，通过病毒和基因协同作用有望进一步提高对胰腺癌的治疗效果，本实验在细胞杀伤实验中充分证实了增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo具有在胰腺癌细胞中特异性增殖杀伤裂解细胞的能力，它所介导的治疗基因的表达在胰腺癌细胞中随着病毒的复制增殖也得到特异性放大，这也从体外实验证明了增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo的构建成功，为我们进一步的体内外研究提供了坚实的基础。

【参考文献】　　[1] Folkman J. Tumor angiogenesis：therapeutic implications[J]. N Engl J Med，1971，285(21)：1182-1186.

　　[2] Folkman J. Antiangiogenesis in cancer therapy--endostatin and its mechanisms of action[J]. Exp Cell Res，2006，312(5)：594-607.

　　[3] Li HL， Li S， Shao JY， et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic study of intratumoral injection of an adenovirus encoding endostatin in patients with advanced tumors[J]. Gene Ther，2008，15(4)：247-256.

　　[4] Khuri FR， Nemunaitis J， Ganly I， et al. A controlled trial of intratumoral ONYX-015， a selectively-replicating adenovirus， in combination with cisplatin and 5-fluorouracil in patients with recurrent head and neck cancer[J]. Nat Med，2000，6(8)：879-885.

　　[5] Nemunaitis J， Ganly I， Khuri F， et al. Selective replication and oncolysis in p53 mutant tumors with ONYX-015， an E1B-55kD gene-deleted adenovirus， in patients with advanced head and neck cancer： a phase II trial[J]. Cancer Res，2000，60(22)：6359-6366.

　　[6] Alemany R， Balague C， Curiel DT. Replicative adenoviruses for cancer therapy[J]. Nat Biotechnol，2000，18(7)：723-727.

　　[7] Kaluz S， Kaluzova M， Stanbridge EJ. Regulation of gene expression by hypoxia： integration of the HIF-transduced hypoxic signal at the hypoxia-responsive element[J]. Clin Chim Acta， 2008，395(1-2)：6-13.

　　[8] Su C， Na M， Chen J， et al. Gene-viral cancer therapy using dual-regulated oncolytic adenovirus with antiangiogenesis gene for increased efficacy[J]. Mol Cancer Res，2008，6(4)：568-575.