大鼠肝组织中卵圆细胞定向迁移的机制研究

作者：涂玉亮    作者单位：中国人民解放军总医院第一附属医院 普通外科，北京 10003     【摘要】  目的 探讨细胞间黏附分子－1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）对大鼠肝卵圆细胞(oval cells，OVCs)在损伤肝组织中迁移的介导作用。方法 致癌剂3'-甲基-4-二甲基胺偶氮苯（3'-methyl-dimethylaminoazo benzene，3'-Me-DAB）饲喂Wistar大鼠，分别于第2，4，6，8，10，12周取肝组织标本行HE染色和 ICAM-1免疫组化检测；第4、6、8、10周取肝组织标本，透射电镜观察OVCs和纤维的生长情况；4周时用Percoll密度梯度离心法分离、纯化OVCs，透射电镜观察OVCs超微结构，ICAM-1免疫细胞化学检测OVCs对ICAM-1的表达。结果 透射电镜下观察到OVCs超微结构的改变为核大，核/浆比大，核仁小，胞浆内细胞器少，可见少量内质网和小线粒体，整个细胞呈幼稚、未分化状态；ICAM-1免疫细胞化学检测阳性；损伤肝组织HE染色和ICAM-1免疫组化检测显示，肝损伤初期，Hering管周围OVCs增生并且ICAM-1阳性表达，随着肝损伤的加重，OVCs继续增生，并且，OVCs沿增生的肝纤维向肝小叶迁移，同时，ICAM-1阳性表达也继续增多，并逐渐向肝小叶弥散分布；透射电镜下观察到，肝损伤初期，OVCs在Hering管周围增生，肝纤维随之增生，增生的OVCs与肝纤维黏附生长。结论 肝损伤不同时期ICAM-1表达的分布与OVCs分布一致，ICAM-1在肝硬化和原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生、发展过程中可能起到介导OVCs在肝内定向迁移的作用。

    【关键词】  细胞间黏附分子－1 卵圆细胞 定向迁移

   Study on the mechanism of directional migration of hepatic oval cells in rats        TU Yuliang， FANG Chihua， LI Jiye， et al.  Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of the General Hospital of PLA，Beijing 100037

    Abstract   Objective  To investigate the induction of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) for OVCs directional migration in liver tissue. Methods  Wistar rats were fed with 0.6 g/kg 3’-methyl-dimethylaminoazobenzene (3'-Me-DAB) in feedstuff for a week. Then liver tissue specimens were gathered in the 2nd， 4th， 6th， 8th， 10th， 12th week， and paraffin sections were stained with HE， immunochemistry and transmission electromicroscope were used to observed the distribution of OVCs and ICAM-1. OVCs were isolated by density ladder centrifugation in the 4th week， and then OVC’s morphology was observed under transmission electromicroscrope and immunocytochemistry were performed to detect the expression of ICAM-1. Results  Observing OVC’s morphology under transmission electromicroscrope showed that OVC was infantile and undifferentiated with big nucleus， clear nucleolus， large nucleoplasm-ratio， small mitochondria， and little endoplast. In initial stage of damaged liver， OVCs and the expression of ICAM-1 mostly distributed around Hering duct， and then gradually increased and expanded toward hepatic lobule， shown by staining paraffin sections with HE， immunochemistry and transmission electromicroscrope. Immunocytochemistry indicated that ICAM-1 expression on OVCs was positive. Conclusion  The expression of ICAM-1 is in accord with distribution of hepatic oval cells， and ICAM-1 is likely to guide OVCs directional migration in the course of the occurrence and development of liver cirrhosis and HCC.

    Key words   intercellular adhesion molecule-1； hepatic oval cells； migration 细胞间黏附分子－1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）可表达于多种细胞，分布广泛。现有研究证明[1]，ICAM-1与原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等许多疾病有关，但其影响机制目前还未有确切结论。方驰华等[2]研究证明药物诱导大鼠肝损伤至肝癌过程中，肝组织中卵圆细胞(oval cells，OVCs)在肝汇管区增生，并逐渐向肝小叶迁移，OVCs在肝硬化和HCC的发生、发展过程中起着重要作用。我们已有研究表明，损伤肝组织OVCs表达ICAM-1[3]，设想，OVCs在肝硬化和HCC的发生、发展过程中向肝小叶的迁移是否与ICAM－1有关？为此，我们通过本实验探讨ICAM-1及其对大鼠OVCs在损伤肝组织中迁移的介导作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验对象  Wistar大鼠64只，雌雄不限，体质量（100±10）g，饲养于南方医科大学动物研究所，常规饲养1周后，饲喂0.06% DAB饲料，正常饮水。

    1.1.2  试剂  3'-甲基-4-二甲基偶氮苯（3'-Me-DAB）购于日本东京化成株式会社；Percoll分离液购自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM-1、即用型SABC试剂盒及DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司；Ⅳ型胶原酶购于Sigma公司。

    1.2  方法

    1.2.1  肝组织标本的采集  Wistar大鼠0.06% DAB饲料饲喂后分别于第2，4，6，8，10，12周取大小约0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm肝组织标本，于4%甲醛固定，制备石蜡切片，常规HE染色，并行ICAM-1免疫组化检测。同时，在第4，6，8，10周取肝组织标本时另取1 mm3大小的肝组织标本，于2%戊二醛固定，待做超薄切片，透射电镜观察OVCs与肝星状细胞及肝纤维的生长情况。

    1.2.2  肝卵圆细胞的分离  参照薛玲等[4]的方法，并加以改进。Wistar大鼠饲喂0.06% DAB饲料4周后，25 mg/kg体质量戊巴比妥钠腹腔麻醉，备皮，3%碘酊和75%乙醇消毒，无菌操作下开腹，门静脉切开插管，25 ml/min灌注D-Hanks液至肝表面淡黄除去肝组织里的血液，然后灌注0.06% Ⅳ型胶原酶至肝组织黄色糜状，将整块肝组织移入烧杯捣碎，于震荡箱37℃恒温震荡消化40 min，经100目筛网过滤，未过滤的组织块继续捣碎，加入0.06% Ⅳ型胶原酶震荡消化40 min，收集过滤液分装于离心管中4℃ 100 g离心10 min，取上层悬液分装于离心管4℃ 1 000 g离心30 min，去上清液，用DMEM基础培养液稀释沉淀。高速离心管分装90%、70%、50% Percoll密度梯度离心液，细胞液铺于上层，4℃    12 000 g离心30 min，吸取70%和50%之间细胞液，DMEM基础培养液稀释，4℃ 1 000 g离心   30 min，弃上清液，用150 ml/L胎牛血清稀释细胞沉淀，至1.0×106/ml的密度。

    1.2.3  透射电镜观察OVCs超微结构  取部分细胞悬液常规离心，固定，包埋，超薄切片，染色，透射电镜观察拍片。

    1.2.4  ICAM-1免疫细胞化学和免疫组织化学（SABC法）  具体操作按试剂盒说明进行，光镜下观察结果。

    2  结果

    2.1  Percoll密度梯度离心法分离、纯化OVCs，光镜下观察  细胞为圆形或卵圆形，体积小，约为成熟肝细胞的1/3（见图1）。

    2.2  透射电镜观察OVCs超微结构  细胞核大，核/浆比大，核仁小，胞浆内细胞器少，可见少量的内质网和小线粒体，整个细胞呈幼稚、未分化状态（见图2）。

    2.3  ICAM-1免疫细胞化学检测  DAB显色剂显色，OVCs表面ICAM-1免疫细胞化学检测明显阳性，表明OVCs确实表达ICAM-1（见图3）。

    2.4  OVCs在损伤肝组织标本中的分布  大鼠饲喂含0.06% DAB饲料后分别于第2，4，6，8，10，12周取肝组织标本，HE染色，光镜下观察，OVCs体积小，约为成熟肝细胞的1/3，呈圆形或卵圆形，胞少，嗜碱性，染色较深，核大，呈圆形或卵圆形。在肝损伤早期（2~4周），可见Hering管周围OVCs增生；肝损伤中期（6~8周），OVCs继续增生，并有肝纤维增生，OVCs沿增生的肝纤维向肝小叶迁移；肝损伤晚期时（10~12周），假小叶逐渐形成，OVCs逐渐减少（见图4）。

    2.5  ICAM－1在损伤肝组织标本中表达的分布  肝组织标本行ICAM－1免疫组化检测，光镜下观察肝损伤不同时期ICAM-1的分布。在肝损伤早期（2~4周），可见Hering管周围ICAM-1阳性表达；肝损伤中期（6~8周），ICAM-1阳性表达明显，并逐渐向肝小叶弥散分布；肝损伤晚期（10~12周），假小叶逐渐形成，ICAM-1阳性表达的细胞逐渐减弱（见图5）。这表明肝损伤不同时期ICAM-1表达的分布与OVCs分布一致。

    2.6  透射电镜下观察损伤肝组织标本中OVCs的分布及其与肝星状细胞的生长情况  药物损伤肝脏4周时可见OVCs在汇管区增生；6周时有肝纤维增生，增生的OVCs与肝纤维黏附生长；8周时肝脏纤维化，大量胶原纤维增生；10周时肝小叶内OVCs与肝纤维紧密黏附生长（见图6）。

    3  讨论

     细胞间黏附分子－1是黏附分子免疫球蛋白超家族的一种重要糖蛋白，它可介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的黏附作用。生理状态下，肝脏中的内皮细胞、上皮细胞及白细胞等多种细胞均可表达ICAM-1，但表达数量不多。本研究用致癌剂DAB饲喂Wistar大鼠致大鼠肝损伤，诱导OVCs增生，参照薛玲等[4]的方法，并加以改进，分离、纯化OVCs，并行ICAM-1免疫细胞化学检测，结果明显阳性表达，表明OVCs确实也表达ICAM-1。Petersen等[5]的研究表明肝损伤时肝组织中有少量肝细胞和肝干细胞来自骨髓造血干细胞（hemopoietic stem cells，HSCs）。Sammons等[6]对外周血的骨髓造血干细胞的归巢研究发现，HSCs表面存在一组以ICAM-1为主的粘附分子，能介导HSCs与骨髓基质的黏附，从而使HSCs产生一种定向迁移的作用。研究表明，OVCs可以来自于HSCs[7]，既然OVCs可来自于HSCs，那么OVCs也应像HSCs一样能表达ICAM-1。此推论与本研究相吻合。

    OVCs是肝脏损伤时出现的具有双向分化潜能的原始细胞，可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞。龚家庆等[8]研究发现，药物诱导大鼠肝损伤至肝癌过程中，肝组织中OVCs在肝汇管区增生，并逐渐向肝小叶迁移。但是，OVCs为什么会向肝小叶内迁移？已有研究表明，OVCs可以来自于HSCs[5]，而且HSCs表面存在一组以ICAM－1为主的黏附分子，能介导HSCs与骨髓基质粘附，并使HSCs产生一种定向迁移的作用[5]。为此，我们先设想大鼠肝硬化损伤模型中OVCs能表达ICAM－1，并由ICAM-1介导与细胞外基质（以肝纤维为主）黏附，沿细胞外基质由汇管区周围向肝小叶内定向迁移。本研究中已发现OVCs表达ICAM-1，这为我们的进一步研究提供了前提条件。我们对损伤肝组织标本行HE染色时发现，肝损伤时早期，OVCs在汇管区增生，随着损伤的加重，肝纤维也随之增生，OVCs沿增生的肝纤维向汇管区周围扩散，至肝损伤晚期，假小叶形成，OVCs明显减少，这可能与假小叶形成、肝细胞增生有关。同时，ICAM-1免疫组化检测结果表明，在不同损伤时期肝组织中ICAM-1的表达与OVCs的分布是一致的，表明OVCs沿增生肝纤维的迁移可能与其表达的ICAM-1有关。同时，在透射电镜下观察损伤肝组织标本，我们也发现，肝损伤初期，OVCs在Hering管周围增生；损伤中期，OVCs和肝星状细胞均增生，胶原纤维大量增生，且OVCs和肝纤维黏附生长；而在损伤晚期，可见OVCs和肝纤维紧密黏附。结合本研究，我们认为肝硬化模型中OVCs能表达ICAM-1，并且ICAM-1可能介导OVCs由沿肝纤维向汇管区周围、肝小叶内迁移。这种迁移对肝硬化假小叶的形成和发展有着重要意义，肝细胞增生、假小叶的形成和癌结节的形成也许与OVCs沿增生肝纤维的定向迁移和OVCs的分化有关。OVCs向肝癌细胞分化的机制有待进一步研究。临床上如果能有效调控OVCs的定向迁移，那么肝硬化假小叶的形成可能得到抑制，从而从早期预防HCC的发生，这对临床上肝硬化和HCC的防治有着重要作用。 

【参考文献】[1] Momosaki S， Yano H， Ogasawara S， et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 in human hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology，1995，22(6)：1708-1713.

[2] Fang CH， Gong JQ， Zhang W. Function of oval cells in hepatocellular carcinoma in rats[J]. World J Gastroenterol，2004，10(17)：2482-2487.

[3] 涂玉亮，方驰华，邹玉华. 大鼠肝卵圆细胞间黏附分子-1的表达及其调控[J]. 第四军医大学学报，2005，26(23)：2149-2151.

[4] 薛玲，文剑明，吴惠茜，等. 大鼠肝卵圆细胞的诱导增生、分离、体外培养和性质鉴定[J]. 中华病理学杂志，1998，27(2)：149-150.

[5] Petersen BE， Bowen WC， Patrene KD， et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells[J]. Science，1999，284(5417)：1168-1170.