Smad4/Smad7在良性胆管狭窄组织中的表达及意义

作者：耿智敏,张晓雪,王林,陶杰

作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061

      【摘要】  目的 研究Smad4/Smad7在良性狭窄胆管组织中的表达，探讨其在良性胆管狭窄形成机制中的作用。方法 采用免疫组织化学SABC法检测Smad4/Smad7在23例良性狭窄胆管组织、6例正常胆管组织中的表达。结果 Smad4在良性狭窄胆管组织和正常胆管组织中的阳性率分别为78.3%、33.3%，组间有明显差异(P<0.05)；Smad7在两组中的阳性率分别为70.0%、50.0%，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 良性胆管狭窄组织中Smad4的高表达是造成胆管成纤维细胞增殖活跃、细胞外基质过度沉积、瘢痕增生的重要因素。

【关键词】  胆管狭窄；Smad4；Smad7；免疫组织化学

基金项目：陕西省科技攻关基金资助项目(2002K10G8)　　Expression and significance of Smad4/Smad7 in benign biliary stricture

　　Geng Zhimin, Zhang Xiaoxue, Wang Lin, Tao Jie

　　Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the expression of Smad4/Smad7 in the tissue of benign biliary stricture and explore its role in benign biliary stricture formation. Methods  Paraffinembedded materials from 23 cases of benign biliary stricture were analyzed for Smad4/Smad7 expression by immunohistochemical streptavidinbiotin complex (SABC) method. Meanwhile, 6 normal cases served as controls. Results  The positive rate of Smad4 was 78.3% and 33.3%, respectively, in the tissue of benign biliary stricture and normal bile duct (P<0.05). The positive rate of Smad7 was 77.0% and 50.0%, respectively, in the two groups (P>0.05), but with no significant difference. Conclusion  The high expression of Smad4 plays an important role in the active fibroblast proliferation, extracellular matrix overdeposition and scar proliferation in the process of benign biliary stricture formation.

　　KEY WORDS: biliary stricture; Smad4; Smad7; immunohistochemistry

　　良性胆管狭窄是指由胆道手术、结石、炎症、感染等导致的胆管纤维组织增生、瘢痕挛缩，目前对其形成机制尚缺乏认识。转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGFβ1)是目前公认与瘢痕形成关系最密切、最具代表性的生长因子[1]。TGFβ的生物学效应通过特定的信号转导途径调控，其中Smads蛋白是通路中的关键步骤，被称为TGFβ信号跨细胞转导的重要换能器[2]。TGFβ1/Smad信号转导通路有正、负反馈调节环路，Smad4/Smad7分别是两个环路中的重要因子[3]。我们采用免疫组织化学方法检测Smad4/Smad7在狭窄胆管组织中的表达，以明确Smad4/Smad7在良性胆管狭窄形成机制中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料及分组

　　选取我院2003年6月-2005年11月手术病理确诊的良性胆管狭窄患者标本23例，其中胆管损伤及损伤修复术后狭窄17例，肝胆管结石3例，炎性狭窄3例，平均病程(或距前次胆道手术时间)16月；男10例，女13例，平均年龄50岁；均经胆肠吻合术治疗出院，平均住院时间22d。6例正常胆管组织取自肝移植术中供体胆管。全部标本经40g/L甲醛固定，常规石蜡包埋后5μm厚连续切片。

　　1.2  试剂  　　兔抗人Smad4单克隆抗体(工作浓度1∶400)，兔抗人Smad7单克隆抗体(工作浓度1∶400)及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。

1.3  方法

　　免疫组织化学SABC法严格按照试剂盒说明操作。主要步骤：切片常规脱蜡至水，H2O2灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，正常山羊血清封闭，分别滴加单克隆兔抗人抗体，4℃过夜；滴加生物素化二抗及SABC复合液，DABH2O2显色，苏木素复染；脱水，透明，封片。

　　1.4  结果判断标准

　　采用改良的Shimizu法[4]。用已知Smad4/Smad7的阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。以胞浆或胞核内出现黄色、棕黄色颗粒为阳性标记。免疫组化表达强度用组织学评分∑pi表示，其中p代表阳性细胞数所占计数细胞百分比，在高倍镜下随机选取10个视野，将阳性细胞所占的百分数≤5%，5%-35%，36%-65%，≥66%分别评分为0、1、2、3分；I代表细胞染色强度，根据细胞内出现黄色的深浅将无显色、淡黄色、桔黄色、棕黄色分别评分为0、1、2、3分；二者评分相加除以2，作为该切片的最终评分，将0、1、1.5-2、2.5-3分别评分为(-)、(+)、()、()。

　　1.5  统计学处理

　　所有数据使用SPSS11.0统计学软件分析，各指标分别计算阳性率；率的比较采用Fisher确切概率法。检验水准：α=0.05。

　　2  结 果

    Smad4/Smad7蛋白主要定位于成纤维细胞的胞质以及胞核内，纤维细胞也可见阳性染色，在大部分狭窄胆管组织中呈阳性表达(图1)。Smad4在良性胆管狭窄组织中阳性率为78.3%，在正常胆管组织中为33.3%，在狭窄胆管组的阳性率明显高于正常胆管组(P<0.05，表1、图2)。Smad7在良性胆管狭窄组织中阳性率为70.0%，在正常胆管组织中为50%，二者相比差异无统计学意义(P>0.05，表2、图3)。表1  Smad4在正常及狭窄胆管组织中的表达（略）表2  Smad7在正常及狭窄胆管组织中的表达（略）

　　3  讨 论

    我们既往的研究表明瘢痕增生是形成良性胆管狭窄的主要原因[57]。在瘢痕形成过程中，作为炎性细胞与修复细胞之间的信号载体，TGFβ1是目前已知与瘢痕形成关系最密切、最有代表性的生长因子。我们既往的研究发现人良性狭窄胆管组织中可检测到TGFβ1及其受体高表达于肉芽组织、成纤维细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞[8]。因此，TGFβ1过量表达或局部持续高浓度可能是导致胆管瘢痕增生的重要原因之一。

    TGFβ的生物学效应是通过特定途径传导的，Smads蛋白是通路中的关键步骤。Smad蛋白在TGFβ转导通路中分为3类[9]：①受体调节型Smads(RSmads)，主要包括Smad2、3；②共介导Smads(CoSmads)，即Smad4，是TGFβ各类信号转导过程中必需的信号中转分子；③抑制性Smads(ISmads)，主要包括Smad7。TGFβ1/Smad信号传导通路是通过正、负反馈调节环路进行自我调控的。TGFβ1可通过Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad通路传递并放大信号，由磷酸化的Smad(PSmad)激活核内TGFβ1启动子，自我诱导内源性TGFβ1的表达，形成正反馈调节环路；与此同时，PSmad激活抑制性因子Smad7的启动子，瞬时上调Smad7表达[10]；Psmad2和Psmad3还可能作用于自身的基因启动子区，自我抑制基因的转录，下调细胞中受体调节型Smads(RSmad)的水平，抑制自身的信号传递[11]。于是，TGFβ1通过激活Smad7和下调RSmad的表达形成负反馈调节环路抑制自身的信号传导。

    本实验观察到Smad4在术后狭窄胆管组高表达，与正常胆管组比较差异有统计学意义(P<0.05)，表明Smad4的高表达与胆管瘢痕增生、良性狭窄形成有着密切关系。这有可能是胆管中持续高水平分泌的TGFβ1信号的持久刺激，以及TGFβ1受体对信号的敏感性增高的结果。狭窄胆管中Smad7的表达水平较正常胆管升高但无统计学意义，考虑可能由于组织差异，在良性胆管瘢痕中Smad7被激活上调，但仍无法在与同样被激活的Rsmad的竞争中占据优势，从而起到有效的拮抗作用。在竞争中占据优势的Rsmad被TGF βRⅠ磷酸化，并结合Smad4移位至核内，对靶基因表达水平进行调节。

 因此，良性胆管狭窄形成过程中TGFβ1水平增高，通过正反馈途径增强自身及受体的表达，使生物活性放大，引起Smad4高表达，同时上调的Smad7发挥不了有效的拮抗作用，使成纤维细胞活跃，扰乱了胶原合成与降解平衡，大量的胶原及其基质成分沉积，导致瘢痕增生，最终狭窄形成。

    根据研究结果，可以设想，利用基因转移技术和细胞或组织工程技术干扰或阻断TGFβ/Smad信号传递过程中的任何一环都可能阻止胆管损伤修复过程中瘢痕纤维化的发展，对这些问题的深入研究有望为有效治疗良性胆管狭窄开辟新的途径。

【参考文献】  　　[1]Schultze MS, Blaese MA, Grabenbauer G, et al. Smad3 and Smad7 expression following antitransforming growth factor beta 1 (TGFbeta1)treatment in irradiated rat tissue [J]. Radiother Oncol, 2004, 70(3):249259.

　　[2]Furuse Y, Hashimoto N, Maekawa M, et al. Activation of the Smad pathway in glomeruli from a spontaneously diabetic rat model, OLETF rats [J]. Nephron Exp Nephrol, 2004, 98(3):100108.

　　[3]Ten DP, Hill CS. New insights into TGFβSmad signalling [J]. Trends Biochem Sci, 2004, 29(5):265273.

　　[4]Shimizu M, Saitoh Y, Itoh H, et al. Immunohistochemical staining of haras oncogene product in normal, benign, and malignant human pancreatic tissues [J]. Human Pathol, 1990, 21:607612.

　　[5]Geng Zhimin, Yao Yingmin, Liu Qingguang, et al. Mechanism of benign biliary stricture: A morphological and immunohistochemical study [J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(2):293295.

　　[6]耿智敏，向国安，韩庆，等. 犬胆肠吻合愈合过程的组织学观察 [J]. 西安医科大学学报, 2000, 21(5):446448.

　　[7]耿智敏，向国安，韩 庆，等. 犬胆肠吻合愈合过程的超微结构观察 [J]. 西安医科大学学报, 2000, 21(6):551553.

　　[8]王林，张晓雪，耿智敏. 良性胆管狭窄组织中TGFβ1及TβRⅠ的表达意义 [J]. 第四军医大学学报, 2007, 28(1):4547.

　　[9]Dennler S, Goumans MJ, Ten DP. Transforming growth factor beta signal transduction [J]. J Leukoc Biol, 2002, 71:731740.

　　[10]Nakao A, Okumura K, Ogawa H. Smad7: a new key player in TGFβassociated disease [J]. Trends Mol Med, 2002, 8(8):361363.

　　[11]Mori Y, Chen SJ, Varga J. Modulation of endogenous smad expression in normal skin fibroblasts by transforming gowth factorβ [J]. Exp Cell Res, 2000, 258(2):374383.