高脂血症对大鼠急性胰腺炎影响及白蛋白的干预效应

作者：王亚军    作者单位：首都医科大学宣武医院 普外科，北京 100053      【摘要】  目的 探讨高脂血症对急性胰腺炎的影响及白蛋白的干预效应。方法 分别用Triton WR1339、Cerulein制作大鼠高脂血症和急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）模型，同时应用两者制作伴有高脂血症的AP模型，应用白蛋白治疗伴有高脂血症的AP，比较各组胰腺病理损害评分、腹水量、胰腺湿/干比、血清淀粉酶和胰腺组织的凋亡；Western blot检测胰腺组织PKC的膜转位。结果 Triton WR1339诱导大鼠高脂血症以TG升高为主，6 h达高峰，升高达20倍，使部分大鼠出现轻型急性胰腺炎。伴有高脂血症的AP组病理评分、腹水量、胰腺湿/干比和血清淀粉酶较Cerulein胰腺炎组均显著升高（P<0.05），白蛋白治疗后均有所下降，但差异无统计学意义。TUNEL法测得伴有高脂血症的AP腺泡出现凋亡数量最多，白蛋白治疗后无明显的变化。合并高脂血症胰腺炎组PKC膜转位比例最高，白蛋白治疗后显著下降（P<0.05）。结论 高脂血症可以诱导AP或加重AP的胰腺损伤，白蛋白治疗不能减轻胰腺的病变。PKC的活化可能是高脂血症加重急性胰腺炎的机制之一。

     【关键词】  急性胰腺炎 高脂血症 蛋白激酶C 治疗 大鼠     Effects of hyperlipaemia on acute pancreatitis and the intervening effect of albumin therapy in rats       WANG Yajun， Sun Jiabang， Li Fei， et al. Department of General Surgery， Xuan-Wu Hospital， Capital Medical University， Beijing 100053

     Abstract   Objective  To investigate the effects of hyperlipaemia on acute pancreatitis (AP) and the intervening effect of albumin. Methods  Hyperlipaemia and AP model were established with Triton WR1339 and Cerulein respectively. AP with hyperlipaemia model was prepared by both Triton WR1339 and cerulein simultaneously. Human albumin was used to treat the AP accompanied with hyperlipaemia. In each group， the histological score， volume of ascites， ratio of pancreatic wet/dry weigh， serum amylase and pancreatic acinar cell apoptosis in each group were compared. The level of protein kinase C (PKC) membrane translocation in pancreatic tissue was detected by Western blot. Results  In the hyperlipaemia model established with Triton WR1339， triglyceride was increased remarkably and reached the peak about 20 times than that of the control group at 6 hour after injection， and mild acute pancreatitis appeared in most rats. Histological score， volume of ascites， ratio of wet/dry weigh and serum amylase in AP with hyperlipaemia group were obviously higher than that of cerulein AP group  (P<0.05) and decreased after albumin therapy， but there was no significant difference (P>0.05). Apoptosis cells detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling  (TUNEL) increased in AP with hyperlipaemia group and did not change distinctly after   albumin therapy. PKC membrane translocation level enhanced mostly in AP with hyperlipaemia group and  decreased remarkably after albmin (P<0.05). Conclusion  Hyperlipaemia may induce AP or intensify pancreatic injury of AP. Albumin therapy can not alleviate pancreatic lesion effectively. PKC activation may be one of the mechanism of AP intensified by hyperlipaemia.

     Key words   acute pancreatitis； hyperlipaemia； protein kinase C； therapy； rats

     高脂血症已成为急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的常见病因之一，但高脂血症在AP中作用的基础研究仍较薄弱，存在一些分歧[1-2]。高脂血症的胰腺毒性主要因为甘油三酯（triglyceride，TG）分解产物游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）的毒性。近年来，已有FFA通过激活细胞内蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）造成细胞损伤导致2型糖尿病的报道[3]，在胰腺腺泡细胞内是否存在类似的机制？因此，进一步研究高脂血症和AP的关系，探讨胰腺腺泡细胞损伤可能的机制，对AP的诊治有着十分重要的意义。

     1  材料和方法

     1.1  动物及主要试剂  雄性SD大鼠（200~250 g）购自军事医学科学院实验动物中心。Cerulein，Triton WR1339(TyloxAPol)，PKC抗体等均为美国Sigma公司产品。细胞原位凋亡检测（TUNEL）试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。

     1.2  方法与步骤

     1．2.1  动物模型的分组  SD大鼠，随机分为：①高脂血症组(Triton)；②急性胰腺炎组(Cerulein)；③高脂血症合并急性胰腺炎组(Triton+Cerulein )；④白蛋白治疗合并高脂血症急性胰腺炎组(Alb+Triton+Cerulein)；各组大鼠12只。正常对照组(Control)6只。

     1.2.2  高脂血症大鼠模型的建立  参考Takahashi等[4]方法，按静脉注射Triton WR1339剂量不同随机分为两组，100 mg/kg组和400 mg/kg组。大鼠过夜禁食，股静脉注射Triton制备高脂血症模型，注射前和注射后3，6，9，12 h分别静脉抽血，检测血清TG、总胆固醇（total cholesterol，TCH）和淀粉酶（amylase，AMY）的浓度。造模后12 h处死大鼠，观察腹水及胰腺大体改变。切取胰腺标本，分成3部分：部分用于计算胰腺湿/干重比值；部分用10％甲醛固定，行HE染色；部分用液氮保存。

     1.2.3  伴高脂血症AP大鼠模型的建立  选择高脂血症模型中血脂最高点的基础上，采用腹部皮下注射Cerulein 20 μg/kg间隔1 h，连续4次复制急性胰腺炎模型[5]。白蛋白治疗伴有高脂血症AP组，于注射Cerulein的同时股静脉注射中等剂量1.25 g/kg人类白蛋白。分别于Caerulein造模后3 h，6 h处死各组大鼠，处理同上。

     1.2.4  胰腺组织的湿/干重比测定  取胰腺组织  0.2 g左右，锡箔纸包裹，测量湿重后放入烤箱内，170℃烘烤24 h，再称重，计算湿/干重比。

     1.2.5  大鼠血脂和AMY测定  全自动生化分析仪。

     1.2.6  病理学检查  参照Pozsar等[6]的方法对胰腺损伤进行评分。

     1.2.7  TUNEL法观察胰腺腺泡细胞凋亡  按试剂盒说明操作。

     1.2.8  细胞膜蛋白和胞浆蛋白样品的制备  取50 mg胰腺组织迅速化冻，置于1.5 ml eppendroff管中，加入5倍于湿重的冰匀浆液匀浆。4℃，10 000 g离心1 h，上清液为胞浆蛋白成分，保存；沉淀再用100 μl胞膜蛋白提取液（上述匀浆液＋1% NP-40＋1 mmol/L Na3VO4），10 000 g继续离心1 h，取上清液作为膜相关蛋白成分。然后用Lowry’s法进行蛋白定量。

     1.2.9  Western Blot法检测细胞PKC的膜转位  从上述制备的每个样品中取出20 μg蛋白，用10% SDS2-PAGE，在4℃、20 mA 的条件电泳115～210 h。电泳完成后，在4 ℃、400 mA、2 h的条件下，将蛋白从SDS2-PAGE上转移到硝酸纤维素(NC)膜上，进行PKC的蛋白印迹实验。NC膜与PKC山羊抗体(1∶2000)温浴后再与二抗结合，经ECL液反应后显影。应用Bandscan 4.30分析软件进行半定量分析。

     1.3  统计学方法  实验结果以x±s表示，采用t检验或Students Newman Keuls-Test。采用SPSS 11.0统计软件，以P<0.05为差异具有统计学意义。

     2  结果

     2.1  高脂血症大鼠血脂、AMY和胰腺组织的变化

     高脂血症100 mg/kg组和400 mg/kg组，造模后TG、TCH均出现升高，TG升高最为明显，6 h达峰值，出现乳糜样血清，100 mg/kg组升高10倍，400 mg/kg组升高20倍。两组TCH分别升高2倍和3倍。注药后血清AMY略有升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。造模后12 h处死大鼠，腹腔无腹水，胰腺无明显的水肿；光镜下，两组分别有4只和5只大鼠胰腺小叶间间隔轻度的增宽，而腺泡间隔较为正常，少数炎性细胞浸润。两组胰腺的干/湿比分别为（1.45±0.11）和（1.50±0.16），两者差异无统计学意义 (t=1.70，P=0.14)。

     2.2  高脂血症对AP胰腺组织的影响  Cerulein造模后3 h，胰腺间质呈水肿改变，小叶间隙增宽，并有少量炎性细胞浸润。造模后6 h，胰腺高度肿胀，被膜紧张，胰腺各小叶因水肿而彼此分开。镜下见小叶间隙和腺泡间隙均增宽，腺泡结构变形，部分腺泡细胞胞浆出现空泡，并有少量炎性细胞浸润。伴有高脂血症AP模型，胰腺病变较前加重，造模后3 h，小叶间隙和腺泡间间隙均增宽，可见少数腺泡细胞出现细胞核的固缩，炎性细胞浸润增多。造模后6 h，胰腺腺泡结构尚完整，排列不规则，腺泡间隙和小叶间隙增宽，其间可见散在的红细胞和炎性细胞，小静脉扩张，红细胞沉积。已有研究认为白蛋白体外可以减轻高TG对胰腺腺泡细胞的损伤[7]，本研究白蛋白治疗组胰腺病理改变与未治疗组相似。

     2．3  大鼠胰腺病理学评分、腹水量和胰腺湿/干比   Cerulein胰腺炎组病理学评分、腹水量和胰腺湿/干比均明显高于正常对照组（P<0.05），而合并高脂血症胰腺炎组上述指标明显高于单纯胰腺炎组（P<0.05或接近0.05），白蛋白治疗伴有高脂血症胰腺炎后病理学评分、腹水量和湿/干比均有所下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组6 h上述指标均高于3 h组，大部分差异无统计学意义（P>0.05）。说明高脂血症加重了AP的胰腺水肿程度，白蛋白治疗没有明显改善。见表1。

     2.4  大鼠血清TG、TCH和AMY的比较  正常对照组大鼠血清TG、TCH浓度最小，Cerulein模型组升高1～2倍，与正常对照组差异均无统计学意义（P>0.05），合并高脂血症时TG、TCH升高最为明显，与单纯高脂血症组相比差异存在统计学意义（P<0.05），白蛋白治疗后TG、TCH均有所下降，但差异无统计学意义（P>0.05）。对照组和高脂血症组AMY无明显的变化，Cerulein组AMY明显升高（P<0.05），而伴高脂血症AP组和白蛋白治疗组AMY较单纯胰腺炎组进一步升高，较单纯AP存在显著差异（P<0.05）。此结果提示：AP可以引起血脂的轻度升高，合并高脂血症的AP可能存在相互作用，血脂进一步急剧升高。白蛋白没有降低血脂和淀粉酶的治疗作用。见表2。

     2.5  大鼠胰腺组织凋亡的比较  在轻型胰腺炎中，胰腺腺泡细胞的凋亡一定程度上反应出病变的严重程度[8]。对正常对照组和实验组6 h大鼠胰腺组织进行TUNEL染色，检测胰腺细胞凋亡情况。正常对照组大鼠胰腺组织未见明显的细胞凋亡，Cerulein模型组出现少量散在的腺泡细胞凋亡，呈现细胞核浓缩，黄褐色浓染。合并Triton诱导高脂血症时腺泡凋亡细胞增多。白蛋白治疗后凋亡细胞未见明显减少。

     2.6  Western blot检测胰腺组织PKC的膜转位   由图1可见，正常对照组、高脂血症组、Cerulein组、合并高脂血症胰腺炎组织胞浆内PKC(Cytosolic PKC)的含量逐渐减少，白蛋白治疗组又明显升高；而膜相关成分内PKC(Particulate PKC)的含量在前四组逐渐增高，白蛋白治疗组又明显下降。计算PKC膜转位的比例（膜相成分内PKC的光密度/胞浆+膜相成分内PKC的光密度×100％）[9]，此结果提示，高脂血症可以诱导正常胰腺和AP胰腺组织的PKC的活化，与上述的胰腺病变程度一致。白蛋白显著降低了PKC的活化。

    3  讨论

     甘油三酯的升高是高脂血症性胰腺炎的主要发病原因，所以，建立动物模型研究高脂血症对AP的影响时，最好有甘油三酯的明显升高。用Triton WR1339诱导大鼠高脂血症，TG升高达20倍，TCH仅升高2～3倍。因此，Triton WR1339为理想的以甘油三酯升高为主的高脂血症大鼠模型。

     高脂血症大鼠腹腔和胰腺无明显的改变，但大部分胰腺组织在光镜下出现胰腺小叶间间隔轻微的增宽。因此，严重高脂血症可以导致轻型急性胰腺炎。大鼠在造模后血清淀粉酶也均有轻微升高，但造模前后差异无统计学意义（P>0.05）。由于本研究需要观察高脂血症对AP的影响，我们选择药物诱导内源性血脂升高的高峰点上继续制造胰腺炎模型，理论上这样高脂血症的影响就会得到最大的体现，所以，建立大鼠高脂血症模型6 h后注射Cerulein，得到伴有高脂血症的AP模型。既往有研究认为白蛋白可以减轻高甘油三酯对胰腺腺泡细胞的损伤[7]，所以经股静脉注射中等剂量人类白蛋白，观察胰腺损伤的变化情况。结果，高脂血症加重了胰腺水肿、腹水量、细胞的凋亡程度，白蛋白治疗后无明显下降。伴高脂血症组TG升高异常显著，高脂血症可能加重了AP，AP又进一步加重了高脂血症，高脂血症和AP之间存在恶性循环，因此，降脂是治疗AP的一个重要方面。白蛋白并不能减轻高脂血症对AP的损害，究其原因，高脂血症是否存在其他的胰腺损伤途径?或者胰腺局部因脂肪酶的大量产生而产生高浓度游离脂肪酸，而没有高浓度白蛋白?当然，本研究在治疗白蛋白浓度和观察时间点上还偏少，也可能存在一定的偏倚。

     目前，高脂血症引起AP的机制主要集中在FFA的毒性作用。研究显示，FFA可以通过激活PKC抑制胰岛β细胞分裂、增殖，诱导β细胞的凋亡，减少胰岛素的分泌[10]。同样，在胰腺腺泡细胞内也存在大量各种亚型的PKC，FFA是否也会通过类似的信号途径激活PKC发挥作用？本研究结果显示，高脂血症大鼠胰腺组织PKC激活增加，合并高脂血症的胰腺炎胰腺组织PKC激活最为明显，PKC的激活水平与胰腺病变程度呈一致性。此说明，PKC的激活可能参与了高脂血症诱导或加重AP。白蛋白治疗合并高脂血症胰腺炎后，胰腺组织PKC膜转位的比例明显下降(P<0.01)，提示白蛋白可能通过降低了FFA而减少了PKC的激活。虽然白蛋白治疗后PKC激活显著下降，但胰腺的损伤只是轻度下降，差异无统计学意义（P>0.05）；此结果亦提示，PKC的激活是高脂血症加重AP的一个重要方面，但可能还存在其他的机制。

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