联合应用拉米呋定和乙肝免疫球蛋白预防肝移植术后乙肝复发的疗效观察

作者：施晓敏    作者单位：第二军医大学附属长征医院 全军器官移植研究所，上海 200003     【摘要】  目的 对热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）与大鼠肝移植术后早期急性排斥反应进行相关性研究，探讨其中的免疫学机制。方法 建立改良“二袖套法”大鼠原位肝移植模型，将大鼠分为A组（冷保存1 h同基因组），B组（冷保存18 h同基因组），C组（冷保存1 h异基因组），D组（冷保存18 h异基因组），术后收集大鼠肝脏组织和血清，用免疫组织化学及Western blotting方法检测HSP70在移植肝脏中的表达，观察其与病理学检查的相关性。结果 冷保存时间的延长可以诱导移植肝组织HSP70的高表达，移植肝HSP70表达水平的升高与大鼠原位肝移植术后早期急性排斥病理学评分之间存在着明显的正相关性（P<0.05，r=0.928）。结论 HSP70的升高可能与大鼠原位肝移植术后急性排斥的早期发生以及大鼠移植术后2周存活率密切相关。

    【关键词】  大鼠 肝移植 急性排斥 热休克蛋白质类

    Correlative study between heat shock protein 70 and the early acute rejection after orthotopic liver transplantation in rats    SHI Xiaomin， FU Zhiren， DING Guoshan， et al. Organ Transplantation Institute of PLA， Changzheng Hospital， the Second Military Medical University， Shanghai 200003

    Abstract   Objective  To do a correlative research between heat shock protein (HSP) 70 and early acute rejection after liver transplantation in rats and explore its immunity mechanism. Methods  Modified Kamada’s two?鄄cuff method was used for establishment of orthotopic liver transplantation in rats. BN （Rt1n） and LEW （Rt1l） rats were randomly divided into four groups. Recipients’ specimens were collected for test， the grafts were harvested on the 2， 4 and 6 posttransplantation day and were used to detect the expression of HSP70 with immunohistochemistry and Western Blotting quantitative methods. The correlation between HSP70 and pathological findings was observed. Results  Prolonged cold ischemia not only up?鄄regulated the expression of HSP70， but also advanced peak value of the expression of them. There was a significant correlation between expression of HSP70 and reject activity index in allografts groups (P<0.05， r=0.928). Conclusion  The increased level of HSP70 may be related to the occurrence of the early acute rejection， and the survival rate of two weeks after liver transplantation in rats.

    Key words   rats； liver transplantation； acute rejection； heat shock proteins

    热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是生物体在不利环境因素刺激下应激合成的一组特殊的蛋白质，它广泛存在于自然界原核及真核生物中。HSP种类有10多种，其中HSP70是生物体内含量最多和颇受研究的一种HSP蛋白，它除了在扮演分子伴侣﹑参与胚胎发育﹑调节细胞凋亡﹑调节细胞内突变蛋白的表达和应激保护等方面具有重要功能，而且在天然免疫和适应性免疫中也扮演着重要的角色[1-2]。近年来，研究表明HSP70参与移植免疫反应并发挥重要的作用，因而引起了广泛的关注，成为新一轮的研究热点。本文对HSP70与大鼠肝移植术后早期急性排斥反应进行相关性研究，探讨其中的免疫学机制。

    1  材料和方法

    1．1  材料  健康纯系雄性清洁级LEW（Rt1l）大鼠和BN（Rt1n）大鼠（北京维通利华实验动物有限公司提供），质量150～180 g，供﹑受体体质量差≤10%，受体略大于供体。自制袖套及内支撑管：门静脉袖套采用6F动脉导管外鞘；肝下下腔静脉袖套为外径2.8 mm﹑内径2.6 mm的聚乙烯管；胆总管内支撑管为麻醉用硬膜外导管所制。4℃器官保存液：UW液（美国威斯康星大学保存液，百时美施宝公司购得）。

    1．2  方法  大鼠原位肝移植模型的建立采用改良Kamada双袖套法，肝动脉不重建[3]。大鼠术前禁食12～15 h，供体采用氯胺酮100 mg/kg肌内注射麻醉，受体术前30 min肌内注射阿托品0.1 mg/kg，术中扣戴面罩乙醚吸入麻醉，清洁手术。大鼠肝移植术后灯照保温2 h，自由进食饮水，单笼喂养。术后不再给予抗生素和任何静脉补液，术后饲养环境温度维持在22～24℃，每天记录大鼠活动情况。

    1．3  实验分组  大鼠随机分为4组，每组15对，热缺血时间均为0 min。A组（冷保存1 h同基因组）：BN→BN，供肝冷保存时间为1 h；B组（冷保存18 h同基因组）：BN→BN，供肝冷保存时间为18 h；C组（冷保存1 h异基因组）：LEW→BN，供肝冷保存时间为1 h；D组（冷保存18 h异基因组）：LEW→BN，供肝冷保存时间为18 h。各组分别于术后 第2，4，6天，每个时点杀死3 只大鼠收集肝脏组织和血清作相应检测，取其中部分新鲜肝组织放入液氮冷冻，    －80℃保存，用于Western?鄄blotting检测。各组剩余6只大鼠用于观察术后2周的存活率。

    1．4  检测指标

    1．4．1  肝功能检测  大鼠下腔静脉取血2 ml，    3 000 r/min 离心10 min，取上层血清用BeckmanCX7全自动生化分析仪测定大鼠肝移植后各时点血浆中总胆红素（total bilirubin，TB）正常值为1.7～5.2 μmol/L、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）正常值为30～52 U/L。

    1．4．2  肝脏组织病理观察  光镜观察：所有肝组织均取自肝中叶，取下组织放入10%中性甲醛溶液中固定24～48 h，常规脱水、透明，石蜡包埋、切片   （5 μm），HE 染色，光镜观察。移植肝组织排斥反应病理学评分标准选用Banff 97方案[4]：排斥活动指数（rejection activity index，RAI）总积分为9分，0～2分定为无排斥，3分为交界性改变，4～5分为轻度排斥，6～7分为中度排斥，8～9分为重度排斥。

    1．4．3  Western blotting法从蛋白水平检测HSP70的表达  ①兔抗大鼠HSP70多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。②步骤：a.蛋白样品的制备；b.蛋白浓度的测定（BCA-100蛋白定量测定法）；c.SDS?鄄PAGE电泳；d.转膜；e.免疫反应；f.化学发光﹑显影﹑定影；g.凝胶图像分析。

    1．4．4  免疫组织化学实验  ①单克隆﹑多克隆抗体及试剂盒：小鼠抗大鼠HSP70单克隆抗体购于武汉博士德生物有限公司；即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。②结果判定：阳性反应为胞膜或胞浆有棕黄色颗粒沉积，胞膜、胞浆内均无反应者为阴性。阳性细胞百分率判定：<1%为“-”﹑1%～10%为“+”﹑10%～50%为“++”﹑>50%为“+++”。

    1．4．5  TUNEL法检测移植肝细胞的凋亡  ①实验中用Roche公司In Situ Cell Death Detection Kit，POD试剂盒原位细胞凋亡（TUNEL 法）检测移植肝细胞凋亡情况。②光学显微镜下观察发现细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞，阴性对照用0.0l mol/L PBS代替TUNEL液。每例切片10个随机200倍视野中的凋亡细胞平均数即为凋亡指数（apoptosis index，AI）[5]。

    1．4．6  统计学方法  实验所得计量资料用算术平均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS11.0进行两组之间t检验，术后生存时间比较采用对数秩和检验log-rank方法，P<0.05则认为差异具有统计学意义。

    2  结果

    2．1  实验动物肝功能  同基因组和异基因组不同冷保存时间ROLT术后ALT与TB的变化见表1~4。从表1﹑2可见，同基因组冷保存时间18 h ROLT术后第2天和第4天ALT值与TB值分别高于冷保存时间1 h术后ALT值与TB值（P<0.05），而在术后第6天，两组之间ALT值与TB值差异无统计学意义（P>0.05）；表3﹑4则提示：异基因组不同冷保存时间ROLT术后ALT值与TB值在术后第2天﹑第4天和第6天均差异有统计学意义（P<0.05），异基因组冷保存时间18 h ROLT术后ALT值与TB值明显高于冷保存时间1 h术后ALT值与TB值。

    2．2  病理学检查结果  光镜下，冷保存1 h异基因组大鼠肝移植术后第2天光镜下出现汇管区少量中性粒细胞和单核细胞浸润，门静脉和中央静脉内皮出现肿胀，但排斥反应不明显，RAI为0～2分，术后第4天汇管区出现混合性炎细胞浸润和静脉内皮炎，伴部分肝实质变性，RAI为3～4分，术后第6 天排斥反应加重，并出现小胆管增生，RAI为5～7分；冷保存18 h异基因组术后第2 天光镜下汇管区可见炎细胞浸润和静脉内皮炎，RAI为3～5，术后第4 天排斥反应加重，术后第6天最严重，出现汇管区结构破坏明显，大量淋巴细胞和单核细胞浸润（黑箭头所示），静脉内皮炎明显（绿箭头所示），小胆管增生，肝实质桥接坏死，RAI为7～9分，见图1。异基因冷保存1 h组各时间点RAI均较冷保存18h组低，且差异有统计学意义（P<0.05）。

    2．3  免疫组织化学结果  经免疫组织化学检测，HSP70表达阳性的细胞为肝细胞，延长冷保存时间对肝移植术后HSP70的表达具有明显的促进作用。

    2．4  Western blotting方法检测HSP70在移植肝脏中的表达  各组大鼠肝移植术后HSP70在肝细胞表达Western Blotting定量检测结果如表5显示，HSP70在冷保存1 h同基因组各时间点仅有弱阳性表达，与冷保存18 h同基因组相比表达明显较弱（P<0.05），且术后不同时间变化不明显；冷保存18 h异基因组在术后第2天就有较强表达，显著高于冷保存1 h异基因组各时间点HSP70的表达（P<0.05），且随时间的延长，HSP70的表达逐渐升高。将HSP70在肝细胞中的表达与移植肝排斥反应进行相关性分析，发现HSP70表达的增加与异基因各组排斥反应之间存在明显的正相关性（P<0.05，r=0.928），与同基因组病理评分无显著相关（P>0.05）。

    2．5  TUNEL法检测移植肝细胞的凋亡变化结果  肝细胞凋亡表现为细胞核中出现棕黄色颗粒。冷保存1 h同基因组ROLT术后移植物中存在少量的细胞凋亡，而冷保存18h同基因组ROLT术后细胞凋亡明显，两组各时间点相比，肝细胞凋亡指数差异均存在统计学意义（第2天：P=0.026，第4天：P=0.033，第6天：P=0.033），另外同基因各组术后肝细胞凋亡指数变化均不明显；异基因两组ROLT术后细胞凋亡均较明显，随着排斥的加重，凋亡细胞逐渐增多，统计学分析提示异基因两组之间术后各时间点差异存在统计学意义（第2天：P=0.028，第4天：P=0.025，第6天：P=0.022）。由此可见，冷保存时间的延长可以增加同基因组和异基因组术后肝细胞凋亡数。

    2．6  各组大鼠存活率的观察  同基因组不同冷保存时间ROLT术后2周存活率情况见表6，分析两组存活天数（P=0.528，P>0.05），提示同基因组不同冷保存时间ROLT术后2周存活率差异无统计学意义。异基因组不同冷保存时间ROLT术后2周存活率情况见表7，经SPSS11.5统计软件包分析P=0.023<0.05，差异有统计学意义，提示异基因组18 h冷保存时间ROLT术后2周存活率低于1 h冷保存时间ROLT术后2周存活率。

    3  讨论

     热休克蛋白基因在同种异体移植物中表达的实质目前还不清楚。可是，考虑到以下情况：①HSPs存在于所有细胞。②HSPs的基因位于主要组织相容性复合体中。③在所有同种异体排斥组织中均有HSP的表达。可以预见HSP与同种异体排斥有关。

    首先将HSP70与器官排斥联系起来的研究是Currie等[6]，他们观察了HSP70在异位移植大鼠心脏和其他组织中的合成，并且证实了在发生排斥供者的心脏中HSP70的表达发生增量上调。其他的研 究[7-8]也提示随着大鼠心脏同种异基因移植物排斥的发展，HSP70基因和蛋白的表达持续增加，并且这种表达显示出与同种异基因移植物排斥的发展呈相关性，当有排斥的动物受到治疗或用环孢素A预防排斥出现后HSP70的表达减弱。

    2004年Mehta等[9]通过小鼠皮肤移植来确定HSP72（HSP70高度诱导性亚型）在急性排斥中如何和怎样发挥免疫作用的实验更有说服力。在实验中，他们将HSP72基因敲除的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠（作为对照组）的尾巴皮肤移植到B10BR小鼠的躯干上，将B10BR小鼠尾巴的皮肤分别移植到HSP72基因敲除的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠的躯干上，并观察移植皮肤的排斥情况。结果发现，来自HSP72基因敲除的C57BL/6小鼠皮肤移植后存活时间长，移植皮肤的排斥程度显著低于对照组。这意味着供体移植物HSP72的出现上调了受体免疫系统急性排斥反应，HSP72 KO C57BL/6小鼠作为供体降低了受体CD4+淋巴细胞的抗原提呈。因此，来自供体细胞的HSP72分子被认为通过抗原提呈诱导受体免疫反应。

    因此，Davis研究小组[10]认为，HSP70在同种异体移植物中的增加是排斥反应过程的一个功能性成分，而不仅仅是结果，HSP70是免疫反应的潜在性抗原物质，并参与了排斥的发生。

    在实验中我们注意到，冷缺血时间的延长使得HSP70在同基因组和异基因组移植肝细胞上的表达均上调，同时异基因组移植肝细胞中的表达水平在术后第2、第4和第6天均明显高于同基因移植组，而且与排斥反应的组织学表现相一致。此外，异基因移植肝细胞中HSP70的表达水平在术后逐渐升高，与时间有一定的相关性，而同基因移植肝脏中HSP70的表达水平却无此变化，基本上保持一致。结果提示，在大鼠肝移植后，由于手术和缺血再灌注损伤等刺激，使移植肝脏表现出一种应激反应，促使HSP70基因的转录，而冷缺血时间的延长增加了这一转录活动。HSP70一方面具有保护细胞免受损伤的功能，另一方面又具有协同免疫的作用。由于冷缺血时间的延长使得移植后肝细胞发生大量凋亡，HSP70被释放到细胞外，向天然免疫系统的细胞，尤其是APCs发出显著的周围细胞损伤的警告信号；细胞外HSP70将诱导DC细胞的成熟并通过受体与APCs相互发生作用，将抗原肽递呈给APCs，刺激APCs分泌炎性细胞因子和趋化因子，促进免疫反应的发生；同时静息的T细胞由于获得APCs呈递的抗原和危险信号的双重刺激而活化，引起强烈的急性排斥反应，排斥反应将进一步刺激移植物合成HSP70，从而形成一种恶性循环，降低了异基因组大鼠肝移植术后2周的存活率。

    通过本次实验，我们发现HSP70升高可以诱导和加重大鼠原位肝移植术后急性排斥的早期发生，这为新型免疫抑制剂的开发和同种异体移植物急性排斥的了解提供了一个新的思路。

【参考文献】[1] Milani V， Noessner E， Ghose S，el a1. Heat shock protein 70：role in antigen presentation and immune stimulation[J]. Int J Hyperthermia，2002，18(6)：563-575.

[2] Srivastava P K， Menoret A， Basu S， et a1. Heat shock proteins come of age：primitive functions acquire new roles in an adaptive world[J]. Immunity，1998，8(6)：657-665.

[3] 施晓敏，史永照，傅志仁，等． 大鼠原位肝移植模型的技术改进[J]． 第二军医大学学报，2006，27(10)：1056-1058．

[4] Anonymous． Banff schema for grading liver allograft rejection： an international consensus document[J]． Hepatology，1997，25(3)：658-663．

[5] Patel T． Apoptosis in hepatic pathophysiology[J]． Clin Liver Dis，2000，4(2)：295-317．

[6] Currie RW， Sharma VK， Stepkowski SM， el a1. Protein synthesis in heterotopically transplanted rat heats[J]. Exp Cell Biol，1987，55(1)：46-56.

[7] Baba HA， Schmid C， Wilhelm MJ， el a1. Inducible heat shock protein 70 in rat cardiac allograft and its immunohistochemical localization in cardiac myocytes[J]. Transplantation，1997，64(7)：1035-1040.

[8] Oh KH， Kim JY， Kim D， el a1. Targeted gene disruption of the heat shock protein 72 gene (hsp70.1) in the donor tissue is associated with a prolonged rejection?free survival in the murine skin allograft model[J]. Transpl Immunol，2004，13(4)：273-281.

[9] Mehta NK， Carroll M， Sykes DE， el a1. Heat shock protein 70 expression in native and heterotopically transplanted rat heats[J]. J Surg Res，1997，70(2)：151-155.

[10] Davis EA， Wang BH， Stagg CA， el a1. Induction of heat shock protein in cardiac allograft rejection?a cyclosporine supperssible response [J]. Transplantation，1996，61(2)：279-284.