大鼠自体肝移植中三种不同肝脏灌注方法的比较
发表时间：2010-03-23 浏览次数：484次
作者：苏树炎 霍枫 作者单位：广州军区广州总医院 肝胆外科，广州 510010 【摘要】 目的 比较三种不同的肝脏冷灌注方法的灌注效果。方法 建立大鼠自体肝移植模型60例，通过不同的冷灌注方法（A经门静脉灌注法、B经腹主动脉灌注法、C经门静脉和腹主动脉同时灌注法），比较其灌注效果、术后存活情况和手术时间。结果 A法灌注后光镜下可见小叶间动脉红细胞残存；B法、C法灌注后小叶间动脉、静脉均未见红细胞残留。各组手术时间分别为(50±3.0)min，(53±4.0)min，（58±3.5）min；术后存活率分别为95%（19/20），90%（18/20），80%（16/20）。结论 B法是三种不同冷灌注方法中相对既简单又彻底的一种，对大鼠自体（或异体）肝移植冷灌注可优先选用；但对于非吻合肝动脉及与肝动脉无关的研究也可选用A法灌注；而C法并非必需。
【关键词】 冷灌注 方法 效果 自体肝移植 大鼠 模型
Comparison of three different liver’s perfusions in liver transplantation of rats SU Shuyan， HUO Feng. Department of Hepatobiliary Surgery Guangzhou Army General Hospital， Guangzhou 510010
Abstract Objective To study the result of three different cold perfusing liver methods in rat. Methods The model orthotopic liver autotransplatation in rat was set up. Sixty SD rats were randomly divided into groups A， B， C； the processing method that it was perfused via portal vein， via abdominal aorta and simultaneous via portal vein and abdominal aorta respectively. In the three groups， the result of the liver after perfusion， the operation time and the survival rate were compared. Results There was erythrocytes in the interlobular arteries under the light microscope in group A， and did not find erythrocyte in the interlobular arteries and interlobular veins in group B and group C. The operation time of group A， B， C were (50±3.0) min， (53±4.0) min and (58±3.5) min， respectively； the survival rate was 95%（19/20）， 90%（18/20） and 80%（16/20） respectively. Conclusion The group B correspondingly is the simple and thorough method in the three methods， can be first chosen for rat liver transplantation； but non-hepatic artery anastomosis or the research nothing to do on the hepatic artery may also choose group A， but the group C is not necessary.
Key words cold perfusion； method； result； liver autotransplantation； rats； model
大鼠肝移植模型是肝移植基础研究的理想动物模型。建立良好的模型是肝移植研究的先决条件。而肝脏的冷灌注是大鼠肝移植的重要步骤；良好的灌注是移植成功的保证。我们利用大鼠自体肝移植模型，比较三种不同的冷灌注方法（分别为A经门静脉灌注法、B经腹主动脉灌注法和C经门静脉、腹主动脉同时灌注法）的灌注效果，并对自体肝移植大鼠术后的存活情况及手术时间进行比较，目的是寻找最佳的冷灌注方法。
1 材料和方法
1.1 材料 健康SPF级纯系SD大鼠60只，质量(250±30)g，雌雄各半，购自广州中医药大学。输液泵、普通台灯各1台；4.5号静脉穿刺针、血管夹数个；显微外科器械1套；5-0和8-0尼龙带线缝合针；哈特曼（乳酸林格氏液）、冰袋及氯胺酮麻醉药品；在广州军区广州总医院动物中心SPF级动物房单人完成。
1.2 实验分组 60只大鼠，雌雄分开后随机分成3组，每组20只。A组：经门静脉灌注法；B组：经腹主动脉灌注法；C组：经门静脉、腹主动脉同时灌注法。
1.3 模型建立的主要步骤 大鼠常规禁食12 h，不禁饮水；氯胺酮腹腔注射麻醉，起效后将大鼠固定在自制的手术台上；腹部备皮、消毒，肋缘下腹横切口直接剪开入腹。?譹?訛解剖、游离肝周韧带（以少翻动肝脏为原则）：将肠道用湿纱布覆盖后移至左侧腹腔外，充分暴露术野；显微剪剪开肝下下腔静脉（IVC）之前的后腹膜，游离IVC直至右肾静脉水平；将肾脏向下牵拉，暴露肾上腺及下腔静脉右侧，0号丝线结扎、剪断肾上腺静脉；向上游离右侧后腹膜至肝上下腔静脉（SVC）。剪断镰状韧带，用棉签将肝左叶及肝中叶轻轻的向右翻转，暴露肝食管韧带，0号丝线结扎、剪断肝食管血管；剪断左三角韧带。用5-0尼龙带线缝合针缝扎、剪断左膈血管；用蚊氏钳经左侧钝性游离SVC后壁，使SVC完全游离。肝脏复位，显微剪剪开小网膜。至此除出入肝的管道外肝脏完全游离。?譺?訛游离、暴露穿刺灌注部位：A组游离门静脉：打开肝十二指肠韧带，从肠系膜上静脉和脾静脉汇合处游离门静脉(PV)至肝门部。B组游离腹主动脉：将肠道翻转至右侧，暴露左侧后腹膜，用显微剪于腹腔干上缘剪开后腹膜，以棉签钝性分离，将腹腔干上缘0.5 cm长的腹主动脉完全游离，预留0号丝线作标志及牵拉；同法游离髂总动脉与左肾动脉之间的腹主动脉。C组游离门静脉及腹主动脉：方法合并A、B法。?譻?訛冷灌注肝脏并取材：A组用血管夹阻断PV和IVC，用4.5号静脉穿刺针穿刺PV，推入常温哈特曼3 ml，使肝脏内的血液进入体循环。冷灌注前在SVC上血管夹，并在IVC血管夹稍上方静脉壁剪开约1 mm作流出道，以2.5 ml/min速度通过输液泵灌注0℃~4℃哈特曼20 ml（见图1）。B组于腹腔干以上、髂总动脉以上阻断腹主动脉血流及IVC，于髂总动脉与左肾动脉之间穿刺腹主动脉；推入常温哈特曼3 ml，使腹腔器官（肝脏、脾脏、肾脏及肠道）内的血液进入体循环。余冷灌注同A组（见图2）。C组合并A、B组两种方法穿刺灌注（见图3）。各组在灌注的同时不断用0℃~4℃哈特曼淋注肝脏表面降温。灌注完毕后立刻取肝中叶大小约1 cm×1 cm×1 cm肝组织1块。?譼?訛再灌注恢复肝脏血流：冷灌注完毕后拔出穿刺针，用8-0尼龙带线缝合针修补穿刺点和IVC流出道。依次移去肝上IVC、肝下IVC、门静脉或（及）腹主动脉血管夹，恢复肝脏血流。连续全层缝合腹壁切口。用台灯照射至大鼠苏醒。
1.4 观察方法 观察比较各组的手术时间和术后大鼠的存活情况；观察冷灌注后各组肝脏的大体情况；并取肝中叶大小约1 cm×1 cm×1 cm肝组织1块；置入10%的甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色，400倍光镜下观察肝窦及门管区小叶间动脉和小叶间静脉的灌注情况。
1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件分析数据。各组数据用x±s表示。组间比较采用重复测量数据的方差分析（SNK）；术后存活率间的比较用?字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组的手术时间和术后存活率 见表1。以开始游离肝脏至肝脏再次恢复血流为手术时间，以术后存活≥24 h为手术成功。
2.2 各组灌注完毕的大体观 A组灌注后的肝脏可见部分组织存在淤斑，灌注不甚彻底，B、C组灌注后肝脏呈均匀的土黄色。
2.3 各组大鼠的死亡数目及原因 A组1例死亡，为分离门静脉时损伤门静脉出血过多引起。B组死亡2例，为肝脏复流后未能清醒。C组死亡4例，1例为损伤门静脉出血过多，1例为腹主动脉穿刺点修补失败出血过多，2例为肝脏复流后未能清醒。
2.4 病理切片结果 除2例因游离门静脉出血过多死亡，未行冷灌注，未取材外，余标本在光镜下均未见肝窦、中央静脉有红细胞残留。A组标本门管区的小叶间静脉灌注彻底，未见红细胞残留，但小叶间动脉灌注不佳，可见红细胞残存（见图4）。B、C组门管区小叶间动脉和小叶间静脉均灌注彻底，未见红细胞残留（见图5，6）。
3 讨论
3.1 建立大鼠自体肝移植模型的意义 1973年Lee等[1]首次创建大鼠原位肝移植模型。之后， Kamada等[2]和Miyata等[3]对其进行了改进，分别采用双袖套法和三袖套法吻合IVC、PV和SVC，简化手术步骤，提高存活率。从此，大鼠原位肝移植模型在肝移植基础理论的研究中得到广泛应用。但是，大鼠原位肝移植模型毕竟手术难度大、成功率低、重复性差[4]，而且基本不行肝动脉重建，因此，对于某些研究（如动脉相关及胆道并发症等）明显受限。而吻合肝动脉的大鼠肝移植难度更大，存活率更低。因此，为了降低手术难度，国内学者[5-10]建立自体大鼠肝移植模型，进行一系列研究，在一定程度上有其可行性及必要性。
3.2 三种肝脏冷灌注方法比较的意义 冷灌注目的是洗净血管内残存的血液以免微血栓形成，并保护肝组织以防止退行性变，延长器官的生存能力。因此，良好的冷灌注非常重要。文献中对肝脏的灌注有多种不同方法，如经腹主动脉、经门静脉、经升主动脉[8]及同时灌注腹主动脉和门静脉[9-10]等。由于方法众多，孰优孰劣应有所不同，因此，比较经腹主动脉、经门静脉及经腹主动脉、门静脉同时灌注这三种常用的灌注方法的优劣是有一定意义的。而对于大鼠自体肝移植，不同冷灌注方法的整个手术过程必然对术后存活有不同的影响。寻找一种既简单又存活率高的模型，也是非常有意义的。
3.3 实验结果说明的问题 A灌注法的手术时间最短（与B法、C法比较差异有统计学意义），大鼠的术后存活率高（与C法比较差异有统计学意义）。分析其原因可能为此法操作相对较简单，减少了游离腹主动脉、修补穿刺点等步骤，节省了手术时间，同时也减少出血量和出血几率，这应该是其成活率高的原因之一，因为大鼠出血2 ml即可致死。缺点为肝动脉灌注不彻底，小叶间动脉有红细胞残留，而残留红细胞是否会形成微血栓，是否会增加移植肝胆道并发症，仍有待进一步研究。总之，A灌注法对肝脏的整体灌注不如另外两种方法彻底，对于吻合肝动脉及与肝动脉相关的移植研究可能不适合应用。
B灌注法虽然比A灌注法的手术时间稍延长（约3 min），但这种方法优点在于灌注液可以通过肠系膜上、下动脉及腹腔干流至门静脉和肝动脉，起到对门静脉、肝动脉同时灌注的效果，对肝脏的灌注彻底，同时术后存活率也与A灌注法无明显差异。因此，我们认为此种灌注方法既简单又彻底，为肝脏冷灌注的优先选择。
C灌注法对肝脏的灌注也彻底，但其耗时明显增加，术后存活率也受到一定影响，我们认为此法并无多大意义，完全可以用经腹主动脉穿刺灌注法代替。
总之，通过实验比较，经腹主动脉灌注法是三种方法中最好的一种，对大鼠自体（或异体）肝移植均可优先选用；但对于非吻合肝动脉及与肝动脉无关的研究也可以选用经门静脉穿刺灌注法；而经门静脉、腹主动脉同时灌注法并非必需。
【参考文献】[1] Lee S， Charters AC， Chandler JG， et al. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat[J]. Transplantation，1973，16（6）：664-669.
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[3] Miyata M， Fischer H， Fuhs M， et al. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses[J]. Transplantation，1980，30（5）：335-338.
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