三氧化二砷对肝癌细胞株SMMC-7721[Ca2+]i的影响
发表时间：2010-03-22 浏览次数：590次
作者：程洪军 作者单位：浙江东阳中医院 肝胆外科，浙江 东阳 322100 【摘要】 目的 观察不同浓度三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖及细胞内Ca2+的影响，探讨其在肝癌化疗中的可能机制。方法 MTT法测定不同浓度As2O3对SMMC-7721细胞的抑制作用；Fura2-AM标记细胞内Ca2+，荧光分析仪测定不同浓度As2O3对SMMC-7721细胞内Ca2+浓度的影响。结果 As2O3在0.5～2.0 ?滋g/ml的浓度范围内对肝癌SMMC-7721细胞的生长具有抑制趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；As2O3在0.5，1.0 ?滋g/ml浓度时，对 SMMC-7721细胞内Ca2+浓度的影响，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；当As2O3浓度为2.0 ?滋g/ml，作用时间为48 h，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01），而作用时间至72 h，细胞内Ca2+又恢复至正常水平（P>0.05）。结论 As2O3对SMMC-7721细胞内Ca2+的影响不仅与浓度有关而且与作用时间有关。
【关键词】 三氧化二砷 SMMC- 肝肿瘤 细胞增殖 细胞内钙离子浓度
Effect of As2O3 on intracellular Ca2+ in SMMC-7721 cell line CHENG Hongjun， BAO Guojian， YE Xuanwei， et al. Department of Hepatobiliary Surgery， Dongyang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Dongyang Zhejiang 322100
Abstract Objective To observe the effect of the different concentrations of As2O3 on proliferation and intracellular Ca2+ in SMMC-7721 cell line， and discuss its mechanism. Methods Cell proliferation was evaluated with MTT; [Ca2+]i was labeled with a fluorescence probe Fura2-AM and measurement of fluorescence was monitored with a Thermo Labsystems Fluoroskan Ascent， USA. Results There was an inhibition trend on SMMC-7721 cell proliferation when the concentration of As2O3 ranged from 0.5 to 2.0 ?滋g/ml， but the difference was not significant（P>0.05）. There was no significant difference of [Ca2+]i， when the cells were treated with As2O3 0.5 and 1.0 ?滋g/ml， respectively; When the cells were treated with As2O3 2.0 ?滋g/ml for 48 h， the concentration of intracellular Ca2+ was statistically different from that in the control group cells（P<0.01）. After 72 h of As2O3 treatment， however， the levels of intracellular Ca2+ were not statistically different from that in control group cells (P>0.05). Conclusion The effect of As2O3 on SMMC-7721 displays a dose- and time dependent manner.
Key words arsenict rioxide； SMMC-7721； liver neoplasms; cell proliferation； intracellular Ca2+
三氧化二砷(arsenict rioxide，As2O3)又称砒霜、亚砷酸，为一种剧毒药，长期以来被认为是一种致癌物质，可导致细胞内某些重要的酶失活，干扰细胞代谢以及致染色质畸变等。近年来的研究发现药理浓度的As2O3对急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocyte leukemia，APL)细胞具有诱导凋亡(apoptosis)效应，并通过诱导细胞凋亡而发挥治疗肿瘤的作用。更为可喜的是许多学者的研究发现， As2O3的诱导凋亡效应也存在于某些肿瘤，如膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞等[1-4]。但有关As2O3对肝癌细胞内钙离子（Ca2+）浓度影响的研究较少，因此本研究拟通过观察As2O3对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖及细胞内Ca2+的影响，探讨其在肝癌化疗中的可能机制。
1 材料和方法
1.1 材料 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所， SMMC-7721购自中科院上海细胞所， As2O3(癌灵1号）购自哈尔滨医科大学第一附属医院，四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司，二甲基亚 砜（DMSO）进口分装，Fura2-AM购自Sigma公司， EGTA、TritonX-100试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 SMMC-7721细胞培养 肝癌细胞株生长于含10%胎牛血清及青、链霉素各100 U/ml的1640培养液中，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换1次液。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT法测定细胞生长情况 将浓度为2×106 的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，分别加入0.5，1.0，2.0 ?滋g/ml 浓度As2O3液，对照组不加药，每组3个复孔。分别培养至24，48，72 h后，倒置显微镜观测细胞形态后，每孔加入20 ?滋l MTT（5 mg/ml），继续培养4 h，加入150 ?滋l，0.02 mmol/L DMSO，振荡混匀，用全自动酶标仪比色，570 nm波长处测定各孔的吸光度OD值。
1.2.3 SMMC-7721细胞[Ca2+]i检测 将浓度为2×106的细胞悬液接种于12孔细胞培养板中，细胞贴壁后，分别加入0.5，1.0，2.0 ?滋g/ml浓度As2O3液，对照组不加药，每组3个复孔。分别培养至24，48，72 h后，清洗细胞3次，加入Fura-2/AM，终浓度为2.5 μM，避光，37℃、5% CO2培养箱中培养，孵育45 min。负载后的细胞以含0.2%胎牛血清白蛋白的Hanks液清洗，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。荧光分析仪(美国Thermolabsystems公司)测定[Ca2+]i，计算公式为：[Ca2+]ｉ=Kｄ(Fo-Fmin)/(Fmax-Fo)，Ｋd为Ｆura2与Ca2+反应的解离常数为224 nmol/L，Fmax是Ｃa2+饱和状态下荧光强度即细胞悬液中加入终浓度0.1% Triton×100后测定，Fmin为细胞悬液中加入终浓度5 mmol/LEGTA络合状态下测得。
1.3 统计学方法 统计分析用SPSS10.0进行。所有数据均以x±s表示，统计学处理采用F检验及SNK。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 As2O3对肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制作用
本研究采用MTT法检测As2O3对肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制作用，结果显示，As2O3在0.5～2.0 μg/ml的浓度范围内对肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长具有抑制趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.2 As2O3对SMMC-7721细胞内Ca2+浓度的影响 实验显示，As2O3在0.5，1.0 μg/ml浓度时，对SMMC-7721细胞内Ca2+浓度的影响，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；当As2O3浓度为2.0 μg/ml作用时间为48 h，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01），而作用时间至72 h，细胞内钙离子又恢复至正常水平，详见表2。
3 讨论
郝继辉等[5]观察0.5~8.0 mg/L不同浓度As2O3对体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721生长活力、细胞凋亡、DNA合成能力的影响，结果发现As2O3能显著地抑制人肝癌细胞SMMC-7721 生长，并且具有时间和剂量依赖性。本实验中采用小剂量As2O3 0.5，1.0，2.0 ?滋g/ml浓度，观察As2O3对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。结果表明，0.5，1.0，2.0 ?滋g/ml浓度时As2O3对肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长具有抑制趋势，但差异无统计学意义。Cai等［6］报道当As2O3 10 mg/d治疗肝功能正常的急性早幼粒细胞白血病，1／3患者出现肝损害，7例表现为肝中毒，说明以As2O3治疗肝功能已受损的肝癌患者可能需要选择更小剂量，因此本实验中选择了较小的剂量，结果与郝继辉等的报道不一致，原因可能与实验中采用的药物浓度不同有关。
本实验同时观察了As2O3对人肝癌细胞SMMC-7721[Ca2+]i的影响，结果表明当As2O3浓度为2.0 ?滋g/ml作用48 h，与对照组比较，差异有统计学意义。细胞内Ca2+是一种重要的第二信使，参与调节细胞膜的通透性，影响环核苷酸及磷酸肌醇代谢，调控酶活性等。Ca2+本身作为一种凋亡信号，可调节Ca2+敏感的关键酶如蛋白激酶、磷脂酶、核酸内切酶及谷氨酰氨转移酶等诱导凋亡。有资料表明，[Ca2+]i的变化对细胞凋亡起重要作用，因此本实验选择观察As2O3对人肝癌细胞株[Ca2+]i的影响来探讨其可能的作用机制。本实验中As2O3可能通过以下机制改变胞质Ca2＋浓度[7-8]：?譹?訛直接作用于细胞内Ca2＋转位酶的巯基使胞内外Ca2＋平衡失控；?譺?訛线粒体△ψm下降使得Ca2＋吸收逆转，导致Ca2＋由线粒体转移至胞质。内质网及线粒体内Ca2＋耗竭可直接或通过加强线粒体内氧化应激而导致细胞凋亡。本实验的另一个结果表明As2O3 2.0 ?滋g/ml作用72 h后，SMMC-7721[Ca2+]i又逐渐恢复至正常水平，与对照组比较差异无统计学意义。[Ca2+]i从升高到逐渐恢复至正常的这种变化，推测可能随着作用时间的增加，SMMC-7721细胞通过内质网、线粒体的调节作用，使细胞[Ca2+]i达到平衡，由于内质网钙库（ER）能够释放[Ca2+]i，激发钙依赖的各种生理反应；另一方面，它作为胞内[Ca2+]i的回收站，能够将胞内增加的[Ca2+]i重新泵回ER中以清除胞浆内Ca2+，控制细胞许多生理活动。这一结果表明As2O3的有效作用不仅与浓度有关，也与一定的作用时间有关。如何利用As2O3有效的抗肿瘤作用，同时尽可能降低毒副作用，是值得进一步研究的课题。
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