不同纯化方法对大鼠胰岛收获效果的研究
发表时间：2010-03-17 浏览次数：531次
作者：吴钢 作者单位：复旦大学附属华山医院 普外科，上海 200040 【摘要】 目的 探讨不同纯化方法对提高大鼠胰岛收获效果的作用。方法 随机选取SD雄性大鼠20只，按胰腺消化和胰岛纯化的方法的不同分为4组，消化过程中胆总管灌注胶原酶V，每组5只：①A组：Ficoll-400法纯化胰岛。②B组：光镜下移液吸移管手工挑拣纯化(手工法)胰岛。③C组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000 U/L，Ficoll-400法纯化胰岛。④D组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000 U/L，手工法纯化胰岛。结果 纯化后胰岛的收获量分别为A组（122±25.30）个，B组（179±21.02）个，C组（187±24.89）个和D组（276±24.85）个。乌司他丁灌注组（C组和D组）胰岛细胞的收获量与相应纯化方法的无乌司他丁灌注组（A组和B组）差异有统计学意义（P<0.01）。手工法纯化组（B组和D组）胰岛的收获量与Ficoll-400 纯化组(A组和C组)差异有统计学意义（P<0.01）。结论 手工法可明显提高胰岛的收获量，乌司他丁灌注胰腺对大鼠胰岛分离具有保护作用。
【关键词】 胰岛细胞 分离 纯化 乌司他丁 大鼠
Comparative study on the harvest effect of islets of Langerhans with different purified methods
WU Gang， CAI Duan， WU Jianhua，et al. Department of General Surgery， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040
Abstract Objective To explore how to improve the yield and quality of rat islets with different purified methods. Methods Twenty male SD rats were randomly divided into 4 groups based on different methods of purification. Islets were isolated with pancreatic ductal injection of collagenase V. Group A： Islets were purified with Ficoll-400. Group B： Islets were purified with hand-pick under optical microscopy. Group C： Islets were isolated with pancreatic ductal injection of collagenase V and Ulinastatin and purified with Ficoll-400. Group D： Islets were isolated with pancreatic ductal injection of collagenase V and Ulinastatin and purified with hand-pick under optical microscopy. Results The yield of islet in these four groups was 122±25.30， 179±21.02， 187±24.89 and 276±24.85， respectively. The yield of islet in the groups that isolated with pancreatic ductal injection of collagenase V and Ulinastatin was significantly higher than those groups without Ulinastatin （P<0.01）. The yield of islet in the groups that purified with hand-pick under optical microscopy was significantly higher than that groups with Ficoll-400 （P<0.01）. Conclusion Purification with hand-pick under optical microscopy can obtain more islets. Ulinastatin perfusion can protect the islet from trypsin digestion in the process of separation.
Key words islets of langerhans； separation； purification； Ulinastatin； rats 胰岛移植克服了胰腺移植手术创伤大、并发症多的缺点，可能成为临床替代外源性胰岛素治疗1型糖尿病最有希望的方法之一。但胰岛移植仍存在一些不足，诸如胰岛来源缺乏、必须长期采用免疫抑制剂、移植胰岛发挥作用时间较短以及移植费用居高不下等。只有当足够数量的活性胰岛植入糖尿病受体后胰岛有功能存活，才能逆转糖尿病的高血糖状态，并防止或缓解其并发症的发生和发展。虽然胰岛细胞分离与纯化技术正在不断地得到改善和提高，但所获得的胰岛在数量、活性及纯度上仍然不尽人意。很多作者从胰岛分离与纯化技术的某一方面作改进并报道其结果，本实验在同一实验室和固定实验人员的基础上作相关的对比研究。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性SD大鼠，质量250～300 g，中科院实验动物中心提供。胶原酶V(Sigma，美国)，RPMI 1640、Ficoll-400(均为Sigma，美国)，葡萄糖粉、戊巴比妥钠(上海)，乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司）。水浴箱(北京医疗器械厂)，低温离心机(TOSHIBA，日本)，酶联免疫法胰岛素试剂盒(Rapid Bio，美国)。
1.2 实验方法
1.2.1 胰腺的获取 固定大鼠后备皮，2%戊巴比妥钠120 mg/kg腹腔注射麻醉，无菌条件下剖腹，充分暴露胆总管，于胆总管上端剪一小口，沿切口插入细塑料导管，结扎固定插管，夹闭胰管与小肠相连处。将25 mg Ⅴ型胶原酶溶于15 ml RPMI1640中（A组和B组）或将25 mg Ⅴ型胶原酶+乌司他丁75000 U溶于15 ml RPMI1640中（C组和D组），吸入到20 ml注射器中。剪开大鼠胸腔，剪破心脏处死。胆总管内缓慢注入0.5 mg/ml胶原酶溶液8～10 ml使胰腺膨胀，完整剪下胰腺[1]。
1.2.2 胰岛的分离 将剪下的胰腺于38℃水浴震荡器中放置8～10 min，以120次/min振荡2～3 min，于4℃将未消化完全的胰腺撕碎，人工振荡20～40次以利胰岛脱出，加入冷Hanks液至50 ml，80目网筛过滤，消化液于4℃，1000 r/min平衡离心1～2 min，弃去上清液，冷Hanks液再洗涤离心1次，终止消化。
1.2.3 胰岛的纯化
1.2.3.1 Ficoll纯化法 将沉淀物（A组和C组）用Hanks液再离心洗涤1次，加入25% Ficoll液4 ml混匀，再分别加入23%，20%，11% Ficoll液及Hanks液各2 ml，于4℃ 3000 r/min离心20 min，吸出11%～20%，20%～23% Ficoll截面的胰岛，用Hanks液洗涤离心2次，得到纯化的胰岛。
1.2.3.2 手工纯化法 将沉淀物（B组和D组）用Hanks液再离心、洗涤1次，稀释6～10倍，于低倍光学显微镜下用移液吸移管手工挑拣，得到纯化的 胰岛。
1.2.3.3 根据胰腺标本有无用乌司他丁处理及手工纯化方法分为4组,每组5只:①A组：Ficoll-400法纯化胰岛。②B组：光镜下移液吸移管手工挑拣纯化(手工法)胰岛。③C组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000 U/L，Ficoll-400法纯化胰岛。④D组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000 U/L，手工法纯化胰岛。
1.2.4 胰岛计数 取定量沉淀物镜下计数。采用定量加样器在胰岛悬液中取样3 次，每次50 μl镜检胰岛数量，按如下公式求得胰岛数：胰岛数=3次细胞总数÷3×20 ×样本总量(ml)。
1.2.5 胰岛纯度和存活率的判定 用双硫腙(DTZ) 染色法判定胰岛纯度，胰岛细胞被染成桔红色，外分泌组织不着色。
1.2.6 胰岛功能鉴定 大鼠胰岛素释放试验（酶联免疫吸附测试法，竞争法）进行胰岛功能鉴定。
1.3 统计学方法 所有实验数据均为计量资料，用均数±标准差表示。用SPSS 10.0 for windows软件进行统计学分析，各组资料的比较采用方差分析F 检验。
2 结果
2.1 胰岛收获量和纯度 用双硫腙(DTZ) 染色法判定胰岛纯度，胰岛细胞被染成桔红色，外分泌组织不着色。纯度在镜下用胰岛细胞数量与外分泌组织量的百分比来估计，均>90％，胰岛纯度各组间差异无统计学意义（P>0.05）。胰岛细胞收获量结果见表1。
统计学处理结果表明：胰岛收获量A组与B组差异具有统计学意义（F=15.01，P=0.005），C组与D组差异具有统计学意义（F=32.02，P=0.000），提示手工挑拣法胰岛的收获量高于Ficoll法。A组与C组胰岛收获量差异具有统计学意义（F=16.78，P=0.003），B组与D组差异具有统计学意义（F=44.40，P=0.000），提示在胰岛的消化过程中加入乌司他丁可提高胰岛的收获量。
2.2 胰岛形态观察 乌司他丁组获得的胰岛外膜完整，边界平滑，结构致密。无乌司他丁组获得的胰岛外膜欠完整，部分边界不清。Ficoll-400组获得的胰岛外膜完整，边界平滑，结构致密，但胰岛较小，而光镜下移液吸移管挑拣不但外膜完整，边界平滑，结构致密，而且含有较多较大的胰岛（见图1）。
2.3 胰岛功能鉴定 纯化胰岛在低糖、高糖或高糖+IBMX三种不同条件刺激下分泌胰岛素的情况见表2。
表2显示纯化的胰岛有良好的分泌活性，在不同条件刺激下胰岛素分泌差异有统计学意义（P<0.01），胰岛对不同糖浓度的刺激敏感。各组间在同等条件刺激下胰岛素分泌无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
如何提高供体胰岛分离、纯化后的收获量和质量是胰岛移植成功与否的关键性因素。只有当足够数量的活性胰岛植入糖尿病受体后胰岛有功能存活，才能逆转糖尿病的高血糖状态，并防止或缓解其并发症的发生和发展。自Moskalewskis创立胶原酶消化分离胰岛的方法以来，胰岛分离技术不断得到改进，胰岛在收获量和质量上有一定程度的提高[2-4]。
影响胰岛细胞分离纯化的因素较多，这些因素始终贯穿着整个胰岛细胞分离和纯化过程中，如分离纯化方法的差异、不同消化酶的应用、消化条件的不同程度掌握等都会影响胰岛细胞分离和纯化后的收获量和质量[5-6]。
本研究通过采用不同的分离和纯化方法，由固定的实验人员在相同的实验条件下操作，使各组的实验结果具有可比性，从而探讨哪种方法有利于提高大鼠胰岛分离纯化后的收获量和纯度。研究发现，在分离过程中加入乌司他丁纯化后胰岛细胞的收获量明显多于无乌司他丁组，乌司他丁组获得的胰岛外膜完整，边界平滑，结构致密。无乌司他丁组获得的胰岛外膜欠完整，部分边界不清。乌司他丁是广谱水解酶抑制剂，虽然对胶原酶有所抑制，但并不会对胶原酶的化学结构产生影响。乌司他丁对胶原酶的抑制作用可以通过延长消化时间来克服。乌司他丁的作用包括：①乌司他丁是一种广谱的水解酶抑制剂，具有稳定溶酶体膜的功能，从而抑制溶酶体酶的释放，可有效抑制主要存在于溶酶体中的多种蛋白酶和糖苷酶等。②乌司他丁分子能同时独立抑制多种酶的活性，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明质酸酶等。因此，乌司他丁有效地抑制了消化胰腺过程中释放出的胰蛋白酶，减少了其对胰岛的破坏作用，提高了胰岛的质量和数量[1]。
Ficoll 400组获得的胰岛外膜完整，边界平滑，结构致密，但胰岛较小，而光镜下移液吸移管挑拣不但外膜完整，边界平滑，结构致密，而且含有较多较大的胰岛。但采用光镜下移液吸移管手工挑拣的方法比较费力耗时，分拣一只大鼠的胰岛约需2～3 h。
本研究对如何提高供体胰岛分离、纯化后的收获量和质量进行了初步的比较研究，胰岛的收获量与国外文献所报道的结果仍有一定的差距，需要进一步的摸索和提高。
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